（續(xù):MIQE指南對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)中核酸紫外測(cè)定的要求-上）

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)MIQE核酸質(zhì)控規(guī)則的實(shí)際運(yùn)用

       資料顯示，如同MIQE指南本身在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊的文稿發(fā)表審稿環(huán)節(jié)實(shí)際貫徹落實(shí)情況的遭遇，不同期刊對(duì)文章qPCR實(shí)驗(yàn)checklist的要求并不一致。整體上，按文章中對(duì)核酸質(zhì)量控制過程細(xì)節(jié)披露的詳略不同，常見3種情形。

3.1用心良苦型

       皮膚淀粉樣變性(Amyloidosis cutis dyschromia, ACD)是主要發(fā)生于東亞和東南亞族群的不完全外顯的常染色體顯性遺傳疾病。糖蛋白非轉(zhuǎn)移性基因 B (glycoprotein non-metastatic gene B, GPNM-B)編碼的GPNM-B跨膜蛋白，在表皮的黑色素細(xì)胞中表達(dá)最盛。正常情況下，GPNM B蛋白與自噬蛋白和吞噬小體共定位，參與自噬蛋白被招募到吞噬小體，與溶酶體與吞噬小體融合，促進(jìn)黑色素小體的形成。ACD個(gè)體發(fā)生的基因突變?cè)斐蒅PNMB蛋白分子截?cái)?、在胞質(zhì)中顯著降解和錯(cuò)誤細(xì)胞定位，導(dǎo)致對(duì)黑色素小體的形成、吞噬作用等負(fù)調(diào)控功能的缺失，造成 ACD中黑色素失調(diào)和淀粉樣變。對(duì)轉(zhuǎn)染野生型、突變型GPNM B基因cDNA質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中GPNMB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)證實(shí)，突變體GPNMB mRNA的表達(dá)水平明顯低于野生型轉(zhuǎn)錄本。實(shí)驗(yàn)中，NanoDrop 2000（相當(dāng)于NanoDrop One）被運(yùn)用于以下操作：

1）從HeLa細(xì)胞提取總RNA經(jīng)DNase處理后的總RNA的純度(purity) (A260/A280、A260/A230比值)和濃度 (concentration)測(cè)定（A260）。其結(jié)果為：A260/A280≥1.9，A260/A230≥2，總RNA濃度386–466 ng/μL；

2）取1μg總RNA（約2-3μL提取液）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

3） qPCR反應(yīng)的cDNA用量：上一步反應(yīng)合成的cDNA（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA產(chǎn)量和濃度測(cè)定值不詳）經(jīng)10倍稀釋后，每孔取2μL稀釋cDNA模板，500 nM正、反向引物組, 2× SYBR Green PCR Master Mix在384孔PCR板上構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系完成RT-qPCR和溶解曲線分析。

GPNM-B基因外顯子測(cè)序樣品的準(zhǔn)備過程，同樣采用A260/A280、A260/A230比值檢驗(yàn)核酸純度（A260/A280≥1.8, A260/A230≥2）、Qubit 2.0熒光染料法測(cè)定DNA濃度，還增加1%瓊脂糖凝膠電泳分析步驟以驗(yàn)證DNA是否存在降解。 

3.2中規(guī)中矩型

       這部分刊文的qPCR實(shí)驗(yàn)，核酸樣品質(zhì)量評(píng)估控制環(huán)節(jié)，一般通過測(cè)定260/280、260/230兩項(xiàng)指標(biāo)來評(píng)估所提取的核酸樣品的純度和濃度，測(cè)定指標(biāo)的披露往往被省略。

       由于細(xì)胞在3D培養(yǎng)基質(zhì)支持下懸浮生長(zhǎng)比常規(guī)2D體外培養(yǎng)更接近在體內(nèi)真實(shí)環(huán)境生長(zhǎng)細(xì)胞所具有的形態(tài)、增殖、分化、遷移和基因表達(dá)等特征。因此3D細(xì)胞培養(yǎng)體系統(tǒng)可用于疾病模型構(gòu)建、藥物篩選、細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。采用液滴微流控技術(shù)在單個(gè)細(xì)胞的周圍構(gòu)建起三維水凝膠基質(zhì)環(huán)境，可精確控制細(xì)胞周圍三維凝膠的沉積量。當(dāng)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞粘附于較薄凝膠時(shí)，其體積擴(kuò)張得更快，具有更高膜張力和增加成骨分化功能。間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化標(biāo)志性基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)中，RNA質(zhì)量評(píng)估是這的：純化的總RNA被重懸于15μL RNase-free water (注：模擬中性pH環(huán)境)，NanoDrop 測(cè)定RNA 的濃度和質(zhì)量（concentration and quality）；反轉(zhuǎn)錄采用Superscript-III reverse transcriptase試劑盒；每個(gè)qPCR反應(yīng)孔為50 ng cDNA用量。

       文中沒有披露RNA濃度、質(zhì)量具體測(cè)定指標(biāo)、測(cè)定值、反轉(zhuǎn)錄RNA用量。但給出cDNA用量，說明作者是測(cè)定cDNA的濃度后再根據(jù)吸取體積計(jì)算出cDNA含量。

       另一個(gè)近紅外光免疫療法(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)抗腫瘤療效及機(jī)制的研究實(shí)驗(yàn)中，用Nanodrop測(cè)定260/280、260/230兩項(xiàng)比值對(duì)腫瘤組織的總RNA純度和含量(purity and quantity)進(jìn)行測(cè)評(píng)；取2μg 的總RNA用含RNase抑制劑的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

       這說明實(shí)驗(yàn)人員在測(cè)定總RNA的A260后，根據(jù)儀器給出濃度（μg/μL）值和移液體積計(jì)算出反轉(zhuǎn)錄總RNA用量。但文中沒有提供實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)的cDNA用量，故無(wú)法得知是否進(jìn)行過cDNA濃度的測(cè)定。

3.3 一筆帶過型

       大量qPCR實(shí)驗(yàn)論文中對(duì)核酸質(zhì)量控制過程描述都過于簡(jiǎn)略，與MIQE指南的要求相距甚遠(yuǎn)。

       胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通過激活2型免疫細(xì)胞、增加免Treg細(xì)胞數(shù)量，誘導(dǎo)皮膚分泌脂肪而減少白脂肪堆積，防止肥胖。2021年發(fā)表于Science上的這篇高作披露：在對(duì)皮膚18個(gè)與人類皮膚皮脂生成相關(guān)基因和TSLP基因表達(dá)檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)中，用Nanodrop 1000測(cè)定了總RNA的含量。

       另一項(xiàng)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的、與外周血T細(xì)胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma, PTCL)復(fù)發(fā)有關(guān)的嵌合轉(zhuǎn)錄本（基因融合突變而產(chǎn)生的融合基因表達(dá)的mRNA）FYN-TRAF3IP2、KHDRBS1-LCK和SIN3A-FOXO1的研究項(xiàng)目中，qPCR反應(yīng)前用NanoDrop 2000測(cè)定了嵌和轉(zhuǎn)錄本的濃度和純度。

       磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1, PGK1）是糖酵解過程的關(guān)鍵酶。敲除pgk1基因，抑制了細(xì)胞的糖酵解反應(yīng)，導(dǎo)致小分子代謝物甲基乙二醛(MGx)的積聚，進(jìn)而使PGK1近端半胱氨酸和精氨酸殘基發(fā)生翻譯后的修飾，產(chǎn)生了KEAP1二聚體結(jié)構(gòu)，并伴隨NRF2的積累和NRF2轉(zhuǎn)錄的激活。揭示了KEAP1-NRF2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在應(yīng)激反應(yīng)條件下的細(xì)胞代謝功能調(diào)控機(jī)制。美國(guó)斯克利普斯研究所的大V們用慢病毒載體搭載PGK1、GLO1基因靶向shRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行的基因敲除，靶基因表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)部分，用NanoDrop測(cè)定總RNA的濃度后取500ng-5μg用于cDNA的合成。

       類似案例不勝枚舉。

       可見，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)核酸質(zhì)量評(píng)估環(huán)節(jié)，紫外吸光度評(píng)價(jià)法的測(cè)定指標(biāo)，業(yè)界認(rèn)識(shí)并不一致。評(píng)估方法上重量（Nucleic acid quantification）輕質(zhì)（Contamination assessment、Purity (A260/A280)）的現(xiàn)象依然十分普遍。

四、討論

       嘌呤、嘧啶、核苷、寡核苷酸或核酸（DNA和RNA）分子因共同的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)共軛雙鍵而具有統(tǒng)一的260nm吸收峰特征。260nm的吸光度與所含DNA和RNA、寡核苷酸（PCR引物、探針）的濃度成正比，這是A260用于核酸定量的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)肽鏈的色氨酸和酪氨酸殘基具有苯環(huán)含共軛雙鍵，280nm紫外線吸收峰為其標(biāo)志，故A280被用于蛋白的紫外測(cè)定和計(jì)算蛋白濃度。

       在pH中性溶液中，dsDNA的A260/A280比值為1.8；ssDNA、寡核苷酸鏈和RNA的A260/A280比值為2.0。而溶液含有蛋白質(zhì)（如各種核酸酶、蛋白酶、血紅蛋白、免疫球蛋白等）或酚類殘留時(shí)，核酸A260/A280比值將低于1.8/2.0。有觀點(diǎn)認(rèn)為：RNA樣品的A260/A280比值1.9~2.0屬高純度，1.8~1.9視為輕度蛋白污染，但還可以正常使用；但比值<1.8則視為嚴(yán)重污染，可能干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于DNA，A260/A280比值＞1.9表明有RNA污染；A260/A280＜1.6，視為蛋白質(zhì)/苯酚的中度污染。因此，A260測(cè)試對(duì)應(yīng)于核酸濃度（concentration）測(cè)定，而A260/280比值針對(duì)的是核酸純度（purity），用于評(píng)估吸收峰波長(zhǎng)260nm以上的蛋白、苯酚類污染程度。

       MIQE指南強(qiáng)調(diào)A260、A280測(cè)定須在pH中性溶液中進(jìn)行（溶液的pH值改變引起核酸蛋白分子共軛體系的延長(zhǎng)或縮短，使紫外吸收峰偏移，測(cè)定值相應(yīng)發(fā)生改變。以RNA溶液為例，酸性環(huán)境下報(bào)告的A260/A280值可能比2.0要降低0.2-0.3，而堿性環(huán)境下的測(cè)定值則相反。這是造成不同實(shí)驗(yàn)報(bào)告中A260/A280、A260/A230比值不同一個(gè)不可忽視的重要因素。報(bào)告核酸樣品測(cè)定結(jié)果時(shí)，注明測(cè)試溶液的溫度和pH值更有參考價(jià)值）。眾多文獻(xiàn)中的做法是將核酸溶于不含DEPC、RNase的Thermo Scientific RNase-free water中檢測(cè)。而通常，25℃室溫下新鮮超純水pH值約7.0，是最方便的核酸溶劑來源。

4.1 核酸純度評(píng)估A260/A280之外是否應(yīng)引入A260/A230？

       討論這一話題，是因單一A260/A280指標(biāo)評(píng)估核酸純度的準(zhǔn)確性業(yè)界一直存有爭(zhēng)議。

       首先，因核酸對(duì)250nm-270nm范圍的消光系數(shù)比蛋白質(zhì)高很多，少量蛋白污染（如人為加入5%蛋白質(zhì)）對(duì)A260/A280比值（處于1.96-1.99區(qū)間）影響有限。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈中色氨酸殘基（吸收峰為280nm）比例較高，蛋白的混入才會(huì)出現(xiàn)A260/A280比值顯著改變。純蛋白樣品A260/A280比值為0.57，而只需少量核酸混入即可使比值迅速躥升至1.0上下。因此，A260/A280比值最適于對(duì)蛋白制品中核酸污染評(píng)估，作為指示核酸樣品中蛋白污染程度并不靈敏。

       其次，苯酚、異硫氰酸胍、PEG等提取試劑、雜質(zhì)，在230nm、260nm、280nm波長(zhǎng)附近均有不同程度光吸收，增加A230、A260和A280測(cè)定值，會(huì)干擾A260/A280比值。譬如苯酚殘留，不僅使A230、A260和A280讀數(shù)上升。同時(shí)，因其吸收峰與核酸吸收峰合并后整體遷移移至270nm附近。表面上樣品 260/280 比值接近正?；蚪档?，但樣品吸收峰出現(xiàn)在270nm，且存在260/230比值降低現(xiàn)象，實(shí)際存在苯酚殘留。再如胍鹽、糖原和碳水化合物等，有230nm的吸收峰，雖不影響A260、A280讀數(shù)及260/280比值，但會(huì)壓低260/230比值。此時(shí)樣品260/280值達(dá)標(biāo)，但260/230<1.6，污染是存在的。

       盡管因DNA、RNA樣品A260/A280比值不同，理論上，基因組DNA殘留會(huì)使RNA的比值低于2.0。但基于上述各種復(fù)雜情況，僅憑A260/A280比值是無(wú)法有效確認(rèn)樣品提取過程中基因組DNA的污染及嚴(yán)重程度的。因此，單一A260/A280比值實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸純度，特別是核酸抑制劑污染的評(píng)估，是不全面的。

       克服A260/A280單一指標(biāo)缺陷的有效辦法是核酸樣品波長(zhǎng)掃描分析。以RNA為例，純RNA掃描得到的是一平滑曲線：有A230波谷、A260波峰，A320\A340貼近背景基線；A260/A280≈2.0，A260/A230≈2.0，A260/A215≈1.0。

       部分固定波長(zhǎng)的微量紫外光度計(jì)，如賽默飛的NanoDrop Lite Plus微量紫外光度計(jì)(A230/A260/A280)，無(wú)法進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，可用A260/A280、A260/A230雙比值來評(píng)估污染物的殘留情況。

       事實(shí)上，本文所引文獻(xiàn)中就有實(shí)驗(yàn)采用的是A260/A280 +A260/A230雙比值法。這比SPUD抑制劑測(cè)定法，顯然更加快捷、經(jīng)濟(jì)易行。

4.2 如何評(píng)估RNA樣品中基因組DNA污染？

       qPCR實(shí)驗(yàn)中，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA與殘留的基因組DNA都可作為PCR模板被擴(kuò)增，特別是采用SYBR Green染料標(biāo)記的測(cè)試中，殘留的DNA熒光信號(hào)污染會(huì)影響定量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。因此，去除總RNA中的基因組DNA污染，對(duì)于采用RT-qPCR方法進(jìn)行基因表達(dá)定量分析具有特殊必要性。

       而完全依賴A260/A280單一指征對(duì)核酸污染評(píng)估確有潛在風(fēng)險(xiǎn)。

       由于基因組DNA分子量通常比RNA分子量大得多，在凝膠電泳中遷移率存在明顯差異，因此可通過瓊脂糖凝膠電泳予以有效分離和鑒定。通常，總RNA中如有基因組DNA殘留，DNA條帶因?yàn)檫w移緩慢而滯后于所有RNA條帶，在凝膠上表現(xiàn)為在28S rRNA帶上方、接近上樣孔附件出現(xiàn)新的彌散條帶。MIQE指南規(guī)定，須記錄實(shí)驗(yàn)中對(duì)RNA樣品經(jīng)何種DNase酶及處理?xiàng)l件這一細(xì)節(jié)。同時(shí)建議實(shí)驗(yàn)者提供反轉(zhuǎn)錄操作前樣品的凝膠電泳分析證據(jù)。

       增加瓊脂糖凝膠電泳分析，不僅簡(jiǎn)便易行，還增進(jìn)核酸質(zhì)量評(píng)估的嚴(yán)謹(jǐn)性和測(cè)試結(jié)果可靠性。盡管在MIQE指南屬于核酸提取操作中D類審查事項(xiàng)，但本文所引用多篇刊文的實(shí)驗(yàn)中都采用了該方法。

       A260/A280比值之外，MIQE指南要求記錄（測(cè)試所用具體方法流程）可耐受基因組DNA污染含量的閾值（the threshold cutoff criteria for the amounts of such contamination that are tolerable.），并報(bào)告每個(gè)測(cè)試靶標(biāo)核酸樣品孔、陽(yáng)性對(duì)照樣品（內(nèi)參對(duì)照基因）孔和無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照孔（只有RNA而無(wú)cDNA，可檢驗(yàn)RNA樣品在經(jīng)DNase處理后中是否還有基因組DNA的殘留）的Cq比較結(jié)果（the results from a comparison of Cqs obtained with positive and no-reverse transcription controls for each nucleic acid target.）以證明是否存在基因組DNA污染干擾情形。

4.3 簡(jiǎn)便易行的核酸樣品PCR抑制劑評(píng)估建議

       核酸質(zhì)量評(píng)估控制環(huán)節(jié)還有一審查事項(xiàng)就是PCR抑制劑污染的評(píng)估。

       無(wú)論是MIQE指南與人們實(shí)際工作中執(zhí)行的做法是一致的，即采用核酸樣品連續(xù)倍比稀釋，根據(jù)qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線所計(jì)算的PCR擴(kuò)增效率來證明是否存在PCR抑制劑污染。

       A260/A280 +A260/A230雙比值，可視為PCR抑制劑評(píng)估的間接證據(jù)。

4.5 MIQE指南紫外吸光度法核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)是否有值得商榷之處？

       首先，MIQE checklist表中反轉(zhuǎn)錄步驟，用Amount of RNA（RNA質(zhì)量，即μg或ng質(zhì)量數(shù)）及Priming oligonucleotide concentration都屬于必須報(bào)告內(nèi)容，對(duì)qPCR反應(yīng)cDNA/DNA模板用量不作要求，這不合理。因?yàn)閏DNA轉(zhuǎn)錄效率存在一定程度的基因特異性、反應(yīng)時(shí)間依賴性和各廠家試劑盒合成效率差異化的事實(shí)，相的總RNA用量、RT酶和RT時(shí)間，cDNA合成產(chǎn)量存在差異是完全可以預(yù)料的，這勢(shì)必導(dǎo)致稀釋后上樣的cDNA輸入量不同，再考慮到不同qPCR儀擴(kuò)增性能不一致，不明確cDNA起始用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性就是空話。而現(xiàn)實(shí)情況是，大量刊文中都標(biāo)明qPCR反應(yīng)起始核酸模板用量的做法。

       其次是關(guān)于核酸品質(zhì)紫外評(píng)估方法的問題。不僅A260/A230比值是否應(yīng)該引入問題。對(duì)于Contamination assessment (DNA or RNA)與Purity (A260/A280)的內(nèi)涵與聯(lián)系，MIQE也欠一個(gè)說明的。從指南原文看，核酸污染評(píng)估指的是一種核酸（如RNA）中有另一種核酸(如基因組DNA)的少量殘留污染，并且認(rèn)為A260/A280比值(Purity測(cè)定指標(biāo))下降可認(rèn)定RNA樣品中存在DNA污染。如果Contamination assessment（E類）可用A260/A280比值變化（D類）來準(zhǔn)確評(píng)估，那把二者分別劃為E、D，本身自相矛盾。除非諸如從微量紫外可見光度計(jì)吸光度測(cè)定、瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料法、Agilent 2100 Bioanalyzer, Qiagen QIAxcel等中找到了比A260/A280比值更可靠、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法，否則，作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體系，Contamination assessment (DNA or RNA)的可執(zhí)行性、嚴(yán)肅性難免要大打折扣。

        目前無(wú)論是綜合應(yīng)用類常規(guī)紫外可見分光光度計(jì)（如日立UH5300等），抑或生物學(xué)核酸蛋白測(cè)定用紫外可見光度計(jì)（如eppendorf BioPhotometer Plus、NanoDrop One系列、Implen NanoPhotometer N50及Nano 100/Nano 300等），系統(tǒng)預(yù)置的核酸測(cè)定工作協(xié)議中，A230、A260、A280、A260/A230A和260/A280指標(biāo)早已用作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

       足見在核酸質(zhì)量評(píng)價(jià)具體指標(biāo)的問題上，MIQE指南這把寶刀的確有個(gè)豁口。

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