（續(xù)：試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-上） 

1.3 蛋白組分分離

       NVT轉(zhuǎn)頭分離處理的蛋白樣品類型繁多。若以細(xì)胞膜為界從空間上劃分的話，有膜外來源的藥物組分（如蜂毒素），有定位于細(xì)胞膜上的膜蛋白、激素和藥物受體（如AChRs、雄激素受體）、LDL/HDL脂蛋白、蛋白脂質(zhì)體（proteoliposome）、脂筏(lipid rafts)和菌體的胞膜成份，定位于胞內(nèi)的Pak1-βPIX -GIT復(fù)合物、可溶性胞質(zhì)蛋白（如淀粉樣蛋白-β蛋白前體,AβPP），定位于細(xì)胞器質(zhì)膜上的蛋白-RNA信號(hào)識(shí)別復(fù)合體SRP以及定位細(xì)胞核內(nèi)的TOP1-DNA共價(jià)復(fù)合物、DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的聚合酶β等酶類等。

       各種蛋白有不同的定位，如膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白、分泌蛋白及各種細(xì)胞器蛋白。蛋白的運(yùn)輸與加工定位信號(hào)肽（signal peptide）/信號(hào)序列（signal sequence）引導(dǎo)。識(shí)別和結(jié)合信號(hào)肽的為一種核糖核蛋白復(fù)合物，稱為信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）。當(dāng)SRP與新出現(xiàn)的信號(hào)肽結(jié)合時(shí)，它會(huì)誘導(dǎo)翻譯延伸暫停并引導(dǎo)翻譯復(fù)合體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上的SRP受體結(jié)合。新生肽鏈通過SRP-ER連接的通道進(jìn)入ER，被信號(hào)肽酶（signal peptides）切除。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將信號(hào)肽切除后，蛋白翻譯才能繼續(xù)進(jìn)行，并進(jìn)行蛋白的折疊和修飾。

       真核生物的SRP由一個(gè)7S RNA及6個(gè)與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)亞基組成。這六個(gè)蛋白分別命名為SRP9、14、19、54、68和72。目前已知的是，SRP9/14異二聚體用于在SRP54亞基與新生多肽鏈新信號(hào)序列相互作用時(shí)阻止蛋白質(zhì)翻譯。SRP19則促進(jìn)SRP54與SRP RNA的附著。古菌SRP包含有7S RNA和兩個(gè)SRP19和SRP54蛋白組分。 

       將嗜鹽古菌(Haloferax volcanii)的SRP RNA，SRP19和SRP54三種純化蛋白在37℃高鹽溶液環(huán)境下單獨(dú)或一起孵育重建SRP復(fù)合物。通過NVT轉(zhuǎn)頭蔗糖密度梯度離心與凝膠電泳相結(jié)合的方法，檢查不同梯度離心條帶中的各種復(fù)合物，以解古菌SRP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的組裝機(jī)制。

       將孵育樣品上樣到在 50 mM MgSO4、5 mM DTT、50 mM Tris–HCl、50 mM Tris–HCl（pH 7.2）中制備的 40% - 10% 蔗糖梯度液頂部，用Beckman NVT65轉(zhuǎn)子55000rpm、4℃離心4.5小時(shí)后。通過SDS–PAGE分析所收集的18個(gè)組分中的蛋白質(zhì)、用2%瓊脂糖凝膠電泳分析條帶中的RNA。通過凝膠密度掃描確定每個(gè)條帶組分蛋白（考馬斯藍(lán)標(biāo)記）或RNA（溴化乙錠染色）的含量。

       實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1M KCl中制備的蔗糖梯度條帶中，SRP19與SRP RNA的相互作用有限，但SRP54存在則可增強(qiáng)二者的結(jié)合。沒有SRP19時(shí)，H.volcanii SRP54可與SRP RNA相互作用并在梯度離心中定位于同一條帶。當(dāng)SRP19存在時(shí)所有SRP54都可作為RNA-SRP19-SRP54三聚體復(fù)合物的一部分被檢測(cè)到，且在SRP RNA-SRP54復(fù)合物中可以檢測(cè)到大量SRP19。表明SRP19在古菌核糖核蛋白復(fù)合物中可能處于發(fā)揮增強(qiáng)SRP54結(jié)合的作用。提示SRP54與SRP RNA結(jié)合則很可能是SRP完全組裝不可缺少的部分。

       DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase, TOPs）因其拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑類(TOP1-ADC)抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)身份而備受關(guān)注?；蚪M突變后錯(cuò)誤的核糖核苷酸可以通過TOP1去除。但通過TOP1修復(fù)機(jī)制容易出錯(cuò)，并導(dǎo)致Top1-DNA共價(jià)復(fù)合物（Top1-DNA covalent complexes, Top1cc）形成。而DNA修復(fù)的缺陷會(huì)導(dǎo)致DNA損傷的積累，隨之而來DNA損傷依賴性信號(hào)的傳導(dǎo)是許多人類神經(jīng)發(fā)育/神經(jīng)炎癥性疾病的神經(jīng)變性的核心特征。

       核糖核酸酶H2（(Ribonuclease H2，RNASEH2）是一種基因組監(jiān)視因子，可從DNA中去除錯(cuò)誤結(jié)合的核糖核苷酸（稱為核糖核苷酸切除修復(fù)）及R-環(huán)處理，對(duì)保持DNA 完整性至關(guān)重要。RNASEH2為包含有催化亞基RNASEH-2A、輔助亞基RNASEH-2B和RNASEH-2C亞基的異源三聚體復(fù)合物。其中RNASEH2B亞基介導(dǎo)了RNASEH2復(fù)合物和增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）之間的相互作用，將RNASEH2B定位于復(fù)制病灶。RNASEH2B失活后，DNA復(fù)制中會(huì)頻繁發(fā)生DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB）且難以有效修復(fù)。

       Aicardi-Goutières綜合征（AGS）被認(rèn)為與核酸代謝有關(guān)的基因突變發(fā)生有關(guān)。其中，RNASEH2突變占AGS病例的50%以上。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)RNASEH2B失活的小鼠模型表現(xiàn)出小腦萎縮，白質(zhì)缺陷和神經(jīng)炎癥的AGS典型病變。Top1cc在RNASEH2B缺失小鼠的小腦中的積累增加。證實(shí)，RNASEH2的缺失通過積累復(fù)制相關(guān)損傷（包括基因組核糖核苷酸，R-loops和Top1cc）而損害神經(jīng)細(xì)胞的基因組完整性。

       《獨(dú)立于I型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)核糖核苷酸切除修復(fù)受損引起的神經(jīng)病理學(xué)(Genome Instability Independent of Type I Interferon Signaling Drives Neuropathology Caused by Impaired Ribonucleotide Excision Repair)》一文中Top1cc檢測(cè)的酶免疫復(fù)合物檢測(cè)（immune complex of enzyme, ICE)工作流程，用了將密度梯度離心與Dot-Blot分析的方法，主要步驟包括：

       1）腦組織裂解物加載到CsCl梯度溶液上面（最終自行成密度梯度為0.84-1.72g/mL），用NVT90轉(zhuǎn)子42000rpm在25℃下離心20小時(shí)后，收集Top1cc的顆粒；

       2）Top1cc的顆粒經(jīng)70%乙醇洗滌、干燥后，重懸于TE緩沖液，用25mM磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）稀釋后，用Bio-Rad Dot-Blot轉(zhuǎn)膜；

       3 先檢測(cè)Blot中的蛋白復(fù)合物中，后在室溫下用SYBR Gold染料對(duì)膜進(jìn)行染色評(píng)估DNA的載量。

1.4 亞細(xì)胞組分分離

       NVT轉(zhuǎn)頭在亞細(xì)胞組份分離的應(yīng)用涉及了肌膜、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等特定組織的細(xì)胞器組分，如線粒體、過氧化物酶體、高爾基體及囊泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、自噬體（autophagosomes）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）/外泌體（exosomes）等。

       自噬(Autophagy)是許多細(xì)胞譜系和腫瘤細(xì)胞系中高度保守的過程，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲在內(nèi)許多病原體，可誘導(dǎo)受感染細(xì)胞的自噬。自噬缺陷與病毒感染的持續(xù)、腫瘤發(fā)生有關(guān)?？乖徊娉蔬f（Antigen cross-presentation）對(duì)于誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞和感染性病原體的適應(yīng)性免疫至關(guān)重要。但對(duì)腫瘤細(xì)胞或病原體來源抗原的交叉呈遞中自噬的調(diào)節(jié)相關(guān)機(jī)制了解不多。

       用Bortezomib（用作蛋白酶體活性的抑制劑和自噬的誘導(dǎo)劑）和NH4Cl（用于阻斷溶酶體融合和自噬體降解）處理轉(zhuǎn)染CFP-LC3和OVA抗原的HEK 293T細(xì)胞后，裂解細(xì)胞離心收集上清液，進(jìn)一步以10000xg離心15 min獲得含自噬體的粗大囊泡粗提沉淀（包含有線粒體、溶酶體和自噬體）和含胞質(zhì)組分組成的上清液（含富含GFP-OVA抗原、胞質(zhì)蛋白和微粒體等）。

       將含粗大囊泡部分沉淀重懸于percoll梯度溶液，用NVT65近垂直轉(zhuǎn)頭36000g離心30分鐘后，收集各梯度層的組分（自噬體囊泡密度低于線粒體和溶酶體，可通過密度梯度離心將自噬體囊泡分離），從中回收自噬體囊泡。聯(lián)合使用綿羊抗小鼠IgG、小鼠抗GFP抗體對(duì)GFP-LC3標(biāo)記的自噬體進(jìn)行層析處理，收集流過、洗滌和洗脫液的各層析組分后進(jìn)行進(jìn)一步抗原呈遞分析和Western Blot檢測(cè)。

       實(shí)驗(yàn)顯示：抑制自噬幾乎完全消除了交叉呈遞，而誘導(dǎo)自噬顯著增強(qiáng)腫瘤抗原的交叉呈遞。NH4Cl阻斷自噬體和溶酶體之間的融合，增強(qiáng)了交叉呈遞。研究人員還成功將蛋白質(zhì)抗原Ub-V-GFP-OVA在HEK293T細(xì)胞中的LC3陽性自噬體位點(diǎn)進(jìn)行了定位。而使用黑色素瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)富含自噬體的測(cè)試組分介導(dǎo)了gp100抗原與幼稚pmel-1 T細(xì)胞的交叉呈遞。

       該研究不僅確定了自噬體是抗原隔離、呈遞給樹突狀細(xì)胞的抗原載體，而且交叉呈遞OVA的能力與自噬體的量直接相關(guān)。提示自噬體在開發(fā)針對(duì)癌癥和傳染病治療有效疫苗的巨大潛在價(jià)值。

       迄今為止，依托超速離心技術(shù)建立的最復(fù)雜實(shí)驗(yàn)分析方法恐怕非hyperLOPIT (hyperplexed LOPIT)和LOPIT-DC (LOPIT after Differential ultracentrifugation)技術(shù)莫屬。

       LOPIT是localization of organelle proteins by isotope tagging (同位素標(biāo)記蛋白細(xì)胞器定位分析技術(shù))的簡(jiǎn)稱，是一種既集成有蛋白多肽片段串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tag, TMT)技術(shù)、LC-MS/MS蛋白串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)（tandem mass spectrometry)或SPS (Synchronous Precursor Selection)-based MS3 technology使用串聯(lián)質(zhì)譜（MS / MS）或基于同步母離子選擇的SPS-MS3技術(shù)（synchronous precursor selection MS3 ）和Bayesian temporal clustering analysis（Bayesian時(shí)間聚類分析）蛋白細(xì)胞器定位分析算法，又融合亞細(xì)胞組分超速離心分離的技術(shù)，用于表征和量化蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位（每輪運(yùn)行最多分析16種）的新型空間蛋白質(zhì)組學(xué)方法（spatial proteomics）,可將數(shù)千種蛋白質(zhì)原生態(tài)地精確定位到不同的亞細(xì)胞器（subcellular structures Or organelles），分析胞內(nèi)區(qū)室（intracellular compartments Or cellular compartments）間蛋白質(zhì)定位、定位功能失調(diào)（Dysfunctional protein localization）、蛋白在亞細(xì)胞間動(dòng)態(tài)穿梭事件的中斷（disruption of dynamic shuttling events），借此分析蛋白在細(xì)胞的生理功能或病理進(jìn)程中所扮演的角色。

       LOPIT由劍橋大學(xué)生物化學(xué)系劍橋蛋白質(zhì)組學(xué)中心的K. S. Lilley等人2004年發(fā)布，后又在此基礎(chǔ)上于2016版推出迭代HyperLOPIT（細(xì)胞裂解流程、MS數(shù)據(jù)采集和蛋白質(zhì)定位分類算法有進(jìn)一步改進(jìn)）、2019年的LOPIT-DC版。HyperLOPIT與LOPIT-DC兩套實(shí)驗(yàn)流程的總體步驟、內(nèi)容基本一致，區(qū)別在于第一階段細(xì)胞裂解之后細(xì)胞器、膜蛋白離心分離純化的方法路線。

       HyperLOPIT分析流程中，小鼠胚胎干細(xì)胞 ES-E14TG2a總蛋白的分離包括2項(xiàng)內(nèi)容。

       1）一份培養(yǎng)細(xì)胞用去垢劑裂解，經(jīng)洗滌去除胞質(zhì)蛋白和膜蛋白，完成細(xì)胞核的富集和核蛋白質(zhì)提取；

       2）另一份細(xì)胞裂解，去除細(xì)胞碎片后，采用碘克沙醇的不連續(xù)密度梯度100000xg在4℃離心60分鐘，分別收集含可溶性胞質(zhì)蛋白的上清、兩個(gè)密度梯度溶液界面處的粗膜。

       粗膜組分用裂解緩沖液稀釋后，先經(jīng)200000g下4℃離心40分鐘沉淀，再將膜沉淀重懸，用連續(xù)密度梯度100000g在4℃離心8 小時(shí)，分別收集各浮力密度（buoyant density）帶的膜蛋白組分共20×0.5mL份。

       再將收集的20份膜蛋白組分經(jīng)180000g離心20分鐘后，收集沉淀。

       上述蛋白提取流程中，僅超速離心步驟就消耗了10個(gè)小時(shí)。

       LOPIT-DC是把hyperLOPIT方案中細(xì)胞裂解、MS數(shù)據(jù)采集和蛋白質(zhì)定位分類算法優(yōu)勢(shì)與亞細(xì)胞組分差速離心方法相結(jié)合而開發(fā)的流程。在去除細(xì)胞勻漿液中殘留細(xì)胞后，依各種膜組分沉降速度不同，用差速離心、速度梯次逐級(jí)增加的方法，分別收集膜蛋白、可溶性蛋白組分的沉淀分析。相較于hyperLOPIT工作流程的耗時(shí)冗長(zhǎng)、人力技術(shù)資源和樣品材料大量耗費(fèi)，LOPIT-DC的蛋白分離操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，制備時(shí)間縮短近三倍，并實(shí)現(xiàn)和接近hyperLOPIT水平的分辨率和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果。

       hyperLOPIT流程中單獨(dú)染色質(zhì)和核蛋白制備步驟的引入，有利于分離染色質(zhì)相關(guān)蛋白和其他核蛋白，為核蛋白定位提供更好的解析分辨率。而LOPIT-DC流程對(duì)線粒體和過氧化物酶體的高效分離，對(duì)于研究線粒體、過氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)或蛋白酶體更便利。

       從LOPIT、HyperLOPIT再到LOPIT-DC，都無須純化細(xì)胞器來抽提蛋白成份。相反，收集到的多管蛋白在經(jīng)TMT技術(shù)標(biāo)記后，還會(huì)混合同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜分析。而膜蛋白的交叉污染在質(zhì)譜后數(shù)據(jù)分析過程中，通過細(xì)胞器蛋白定位多變量聚類分析中予以鑒別。這樣既可以判定具有多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)室間分布定位特點(diǎn)的蛋白質(zhì)，又可實(shí)現(xiàn)特定蛋白在特定胞內(nèi)區(qū)室分布豐度的量化及不同干預(yù)刺激、病理生理過程中的動(dòng)態(tài)變化。

       LOPIT及后續(xù)改進(jìn)技術(shù)方法，已在包括擬南芥根部和根來源的愈傷組織，黑腹果蠅胚胎，釀酒酵母細(xì)胞，HEK293人腎細(xì)胞系，DT40雞淋巴細(xì)胞系， E14TG2a小鼠胚胎干細(xì)胞，人肺成纖維細(xì)胞巨細(xì)胞感染和大鼠肝臟細(xì)胞器等多個(gè)蛋白亞細(xì)胞器定位研究項(xiàng)目成功應(yīng)用。

1.5 Beckman NVT轉(zhuǎn)頭實(shí)驗(yàn)應(yīng)用情況小結(jié)
        截止至2023年6月30日的PubMed期刊文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，Beckman 超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭在實(shí)驗(yàn)報(bào)道中出現(xiàn)的頻率，從高到底排名秩序依次是：SW 系列水平轉(zhuǎn)頭、Type Ti系列定角轉(zhuǎn)頭、NVT系列近垂直轉(zhuǎn)頭和VTi 系列垂直轉(zhuǎn)頭。其中，僅SW 41Ti這款水平轉(zhuǎn)頭（6×13.2mL/41000rpm）的報(bào)道文獻(xiàn)記錄就多達(dá)5943條。而使用Type系列角轉(zhuǎn)頭、NVT系列近垂直轉(zhuǎn)頭或VTi系列垂直轉(zhuǎn)頭中任一款轉(zhuǎn)頭的文獻(xiàn)記錄數(shù)量總和不過800次。NVT 65型近垂直轉(zhuǎn)頭的刊文數(shù)量相當(dāng)于報(bào)道使用了VTi 全系列垂直轉(zhuǎn)頭的刊文量之和。

        資料顯示：最早對(duì)Beckman近垂直轉(zhuǎn)頭用于實(shí)驗(yàn)樣品分離公開報(bào)道的是美國(guó)馬薩諸塞州波士頓布萊根婦女醫(yī)院醫(yī)學(xué)部的研究小組。他們?cè)?994年用KBr將人體血漿調(diào)節(jié)至1.21g/ml的密度后，在NVT90近垂直轉(zhuǎn)頭中以80000rpm、不連續(xù)密度梯度超速離心45分鐘，從新鮮血漿制備低密度脂蛋白(LDL) 。調(diào)研收集的NVT應(yīng)用文獻(xiàn)中，55%實(shí)驗(yàn)成果發(fā)表于2012-2023年間?？紤]到定角轉(zhuǎn)頭、水平轉(zhuǎn)頭是最早成功投入商品化服務(wù)轉(zhuǎn)頭類型，再結(jié)合單一型號(hào)轉(zhuǎn)頭文獻(xiàn)報(bào)道量，可以看出，NVT轉(zhuǎn)頭使用增長(zhǎng)的勢(shì)頭明顯，證明了NVT轉(zhuǎn)頭的巨大應(yīng)用潛力。
        近垂直轉(zhuǎn)頭因?yàn)橛幸欢▋A角，被分離樣品可沿管壁向外、向下滑向管底而產(chǎn)生沉淀。這給人的直覺是轉(zhuǎn)頭主要特長(zhǎng)是用于蛋白和細(xì)胞組分沉淀分離。調(diào)研所收集的文獻(xiàn)中，確有多篇與此應(yīng)用有關(guān)。
        如用NVT90轉(zhuǎn)子4℃下80000rpm離心1小時(shí)收集PBS緩沖液中類鼻疽菌Burkholderia pseudomallei外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的沉淀以純化菌體包膜用作免疫動(dòng)物的抗原。對(duì)于人體皮膚真菌群的共生真菌M. sympodialis釋放細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）MalaEx，用到NVT90轉(zhuǎn)子100000g離心沉淀的辦法制備感染單核細(xì)胞及人原代角質(zhì)形成細(xì)胞的感染源。將轉(zhuǎn)染攜帶跨膜蛋白Megf10基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的10T1 / 2成纖維細(xì)胞裂解后，用NVT100轉(zhuǎn)子4℃下65000rpm離心1小時(shí)，將細(xì)胞質(zhì)，質(zhì)膜，核膜和核區(qū)室的蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀分離，可從中驗(yàn)證Megf10在細(xì)胞質(zhì)膜中的分布定位。研究研究人員為探究鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物A（intraflagellar transport complex A, IFT-A）的整體結(jié)構(gòu)及組裝機(jī)制，將原生動(dòng)物四膜蟲（Tetrahymena）全細(xì)胞提取物經(jīng)離子交換色譜層析后，再用NVT65.2轉(zhuǎn)子100000×g在4℃下離心1.25小時(shí)沉淀胞膜以純化IFT-A用于后續(xù)其組成結(jié)構(gòu)的分析。
        需指出，就目前掌握的資料看，近垂直轉(zhuǎn)頭的沉淀功能實(shí)際使用并不普遍。相反，大部分實(shí)驗(yàn)報(bào)道中，是用于單一蛋白組分或蛋白復(fù)合體、基因組DNA/質(zhì)粒/RNA、rAAV病毒載體、細(xì)胞的細(xì)胞器和外泌體和膜脂肪酸等各類生物樣品的連續(xù)或不連續(xù)密度梯度的分離。NVT用于區(qū)帶速度離心和生物組分自形成梯度等密度離心，這一點(diǎn)毋庸置疑。

（待續(xù)：試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-下）