超濾離心管是依托超濾膜（ultrafiltration membrane）的過濾孔徑對(duì)不同分子量大小組分截留功能，用離心力驅(qū)動(dòng)溶液在濾膜表面流動(dòng)時(shí)，鹽分、引物、EDTA、污染物等小分子量溶質(zhì)及溶劑在離心力作用下穿透濾膜濾出，而蛋白質(zhì)、核酸（DNA/RNA）、外泌體及細(xì)微粒子（如微珠、納米材料）等目標(biāo)組分則被截留下來并被收集，實(shí)現(xiàn)樣品中不同組分分離的。只需一個(gè)簡(jiǎn)單操作步驟和短短數(shù)十分鐘，就同時(shí)實(shí)現(xiàn)了樣品組分的純化、濃縮兩個(gè)目標(biāo)?？芍貜?fù)性好，樣品回收率高。所需工作條件溫和可控，有利于保持生物組分的生理活性。因此，超濾離心管處理法在蛋白樣品脫鹽、濃縮和緩沖液更換，高品質(zhì)核酸模板的制備等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都得到廣泛應(yīng)用。

       超濾離心管由超濾膜過濾器和離心管兩部分組成。過濾器上部為圓柱型儲(chǔ)液區(qū)。中部為扁平、呈V型過濾區(qū)，核心是雙排垂直濾膜（twin vertical membranes）。下部為封閉的濃縮液收集槽。工作時(shí)，溶液沿著與濾膜表面平行方向（切向）流動(dòng)，溶劑連同可濾除的小分子組分從濾膜滲出并被甩入離心管底成為濾出液。被濾膜截留的樣品組分則隨切向液流進(jìn)入濃縮液槽。隨著離心的啟動(dòng)，濾出液增加而儲(chǔ)液區(qū)溶液減少。最終,偌大的濾器內(nèi)僅剩濃縮液槽內(nèi)收集的數(shù)十～數(shù)百微升含目標(biāo)組分的濃縮液。

       本質(zhì)上，超濾離心管相當(dāng)于一套安裝于標(biāo)準(zhǔn)錐形離心管內(nèi)的超濾膜過濾器（Centrifugal Filter Devices, Centrifugal Ultrafiltration Units）。超濾器的操作壓、滲透通量、管最大樣品處理量、濃縮液體積和有效工作時(shí)間，均受控于離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的工作性能。純化濃縮操作是用角轉(zhuǎn)頭還是水平轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)頭實(shí)際輸出性能是否符合超濾管工作要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)者而言，這是事先應(yīng)予明辨的重大議題。

一、離心機(jī)轉(zhuǎn)頭屬性對(duì)超濾離心管工作效能的影響

1.1 離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的工作角度

       轉(zhuǎn)頭的工作角度決定了超濾離心管的最大樣品載量、濾膜有效工作面積、95%截留率時(shí)的有效離心時(shí)間及濃縮液體積等多個(gè)工作指標(biāo)。

       首先是管的樣品承載量。水平轉(zhuǎn)頭中，超濾管在離心前后始終處于豎直狀態(tài)，這有利于實(shí)現(xiàn)裝填樣品體積的最大化。角轉(zhuǎn)頭在靜止時(shí)，樣品管呈傾斜狀態(tài)。故在填充移液時(shí)管上部須預(yù)留足夠的閑置空間，以防樣品溶液上機(jī)安裝時(shí)外溢。角轉(zhuǎn)頭傾角越大，管有效上樣容量越小。如Cytiva Vivaspin 20蛋白濃縮管，在水平轉(zhuǎn)頭中工作時(shí)最大載樣量為20mL，而采用25°角轉(zhuǎn)頭離心則樣品最大體積驟降至14mL。

        其次是濾膜工作面積。超濾離心管在水平轉(zhuǎn)頭中工作時(shí)，V型排列的雙膜處于同步工作狀態(tài)。較大的有效濾膜表面積，有利于高效過濾濃縮。而超濾離心管安裝于角轉(zhuǎn)頭中時(shí)，只有靠外側(cè)的一個(gè)膜單元有身體濾液發(fā)生，內(nèi)側(cè)的另一個(gè)膜處于閑置狀態(tài)。因此，此時(shí)濾器的膜總有效工作面積只有水平轉(zhuǎn)頭時(shí)的一半。

       第三是濃縮液的回收體積。水平轉(zhuǎn)頭離心過程中，濾器內(nèi)樣品液面界線由內(nèi)向外水平推移。當(dāng)液面越過濾膜外側(cè)末端進(jìn)入死體積腔時(shí)，液面與濾膜脫離接觸，則膜過濾停止，樣品濃縮達(dá)到最大程度。       

        而角轉(zhuǎn)頭中的離心末期，液面位置分布與在水平轉(zhuǎn)頭中的不同。盡管儲(chǔ)液區(qū)剩余樣品溶液不足以覆蓋單側(cè)濾膜全部表面，但此時(shí)液面依然與濾膜保持有效接觸，被濃縮液體與膜接觸時(shí)間長(zhǎng)于在水平轉(zhuǎn)頭中濃縮液-濾膜接觸時(shí)間。因此，在角轉(zhuǎn)頭中操作所得的濃縮液體積往往小于水平轉(zhuǎn)頭的所得。但同時(shí)，用角轉(zhuǎn)頭離心樣品出現(xiàn)過度離心的風(fēng)險(xiǎn)更高。

1.2 離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的RCF輸出性能

       超濾離心管的工作動(dòng)力來自轉(zhuǎn)頭產(chǎn)生的離心力。在超濾膜耐壓范圍內(nèi)，通過適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)頭RCF輸出來提高操作壓，如從RCF 4000×g升至5000×g，能增加膜流速，促進(jìn)與膜吸附的目標(biāo)組分的解吸附，維持樣品的高回收率。

       將過濾區(qū)左右兩側(cè)壁膜間的夾角表示為a，水平方向離心力用F表示，則此時(shí)F可分解為垂直于濾膜的Fm和平行于膜的Ft兩個(gè)分量。兩個(gè)力的分量分別發(fā)揮促使液體穿透濾膜濾出、沿濾膜表面向液槽底部流動(dòng)的驅(qū)動(dòng)作用。

       在水平轉(zhuǎn)頭中，膜間夾角a通常很小(20°以內(nèi))，故Fm = F. sin(a/2)較小，而Ft = F. cos(a/2)較大。

       較小的Fm意味著水平離心時(shí)作用于樣品溶液的操作壓強(qiáng)小。

       較大的Ft有利于降低目標(biāo)組分與膜的非特異性吸附，從膜表面流入V型槽底，有助于提高樣品回收率。

       若規(guī)定角轉(zhuǎn)頭自身傾角為θ，大小介于為20°- 45°之間。此時(shí)，F(xiàn)m = F·sin(90°-θ+a/2)。顯然，角轉(zhuǎn)頭中產(chǎn)生的Fm大于水平轉(zhuǎn)頭中的Fm。

       Fm的增大提高了超濾膜的操作壓，而膜通量（flux,指單位時(shí)間內(nèi)單位膜面積濾過樣品體積）也相應(yīng)增加，這樣可彌補(bǔ)角轉(zhuǎn)頭中因膜有效工作面積減少的滲透通量損失，可將膜的通量維持在較高的水平。

       理想的超濾性能，需要操作壓（operating pressure）、切向樣品流速大小的適度與二者間的平衡。

       進(jìn)樣操作壓小，則溶液中小分子組分透膜動(dòng)力不足，膜滲透通量低。但切向驅(qū)動(dòng)力過大，則會(huì)抑制小分子量組分的跨膜滲透，膜濾過通量下降。

       相同RCF設(shè)置下，角轉(zhuǎn)頭離心力的兩個(gè)分量Fm和Ft，隨轉(zhuǎn)頭傾角θ的改變而此消彼長(zhǎng)。主流品牌離心機(jī)角轉(zhuǎn)頭傾角有25°、35°和45°之分。工作轉(zhuǎn)頭的傾角θ增大，會(huì)導(dǎo)致Fm的降低和Ft的增加。這直接導(dǎo)致濾膜操作壓下降和切向流速的加大，膜通量降低，使操作時(shí)間延長(zhǎng)。

       賽多利斯、Cytiav Vivaspin超濾離心管使用說明建議用25°角轉(zhuǎn)頭。這不僅是因?yàn)?5°轉(zhuǎn)頭的樣品最大載量相對(duì)較大，更重要的考量因素是25°角轉(zhuǎn)頭中的Fm和Ft兩個(gè)離心力分量間的平衡。

分析表明：

       (1) 只要遵循超濾離心管使用指南提供的轉(zhuǎn)頭、RCF值、離心時(shí)間條件操作，無論采用角轉(zhuǎn)頭、水平轉(zhuǎn)頭離心，都有望獲得理想的結(jié)果；

       (2) 水平轉(zhuǎn)頭上樣量大且回收率高，在轉(zhuǎn)頭RCF滿足要求情況下，選擇水平轉(zhuǎn)頭離心值得肯定；

       (3) 采用角轉(zhuǎn)頭工作時(shí)，超濾管最大載樣量小，但最終濃縮液體積往往較小，故特別適合低豐度組分的濃縮純化。

二、理想超濾離心效果對(duì)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭工作性能的要求

       正因?yàn)槌瑸V離心管的工作中采用的離心力大小及轉(zhuǎn)頭傾角，對(duì)超濾滲透流量、樣品回收率有重要制約效應(yīng)。因此，不同截留分子量（Molecular Weight Cutoff, MWCO）的濾膜、不同樣品容量管在水平、固定角度兩種轉(zhuǎn)頭，工作所需的RCF設(shè)置不同。概言之，50mL-100k Da超濾管工作RCF為3000-6000×g，50mL-3k - 50k Da管所需RCF為4000-8000×g，15ml管工作設(shè)定的RCF高于50mL管。

表1. 品牌超濾離心管工作RCF參數(shù)列表

       超濾離心管使用說明文件中，一方面RCF標(biāo)注為濾膜工作最大RCF值。而另一方面，在產(chǎn)品超濾性能演示實(shí)驗(yàn)中，所用RCF設(shè)置通常正是該限定值。

       操作條件低于產(chǎn)品指南建議RCF設(shè)置，小分子物質(zhì)穿膜動(dòng)力不足，不僅使離心時(shí)間延長(zhǎng)，關(guān)鍵是長(zhǎng)時(shí)間離心后溶質(zhì)在膜表面濃度極化效應(yīng)，使溶質(zhì)易于在膜表面附著和沉積結(jié)垢，一旦膜過濾孔徑和有效面積降低，會(huì)造成膜工作通量和樣品回收率的下降，這對(duì)離心超濾效果是致命的。因此，實(shí)驗(yàn)者對(duì)超濾離心所用轉(zhuǎn)頭，特別是水平轉(zhuǎn)頭的實(shí)際工作性能應(yīng)準(zhǔn)確了解，在轉(zhuǎn)頭的選擇上務(wù)必謹(jǐn)慎。

       超濾管離心需要何等性能的水平轉(zhuǎn)頭？這一問題要從超濾離心管結(jié)構(gòu)的特殊性和水平轉(zhuǎn)頭工作有效RCF輸出兩個(gè)角度來分析。

       超濾離心管的膜過濾區(qū)，整體上位于離心管長(zhǎng)軸中點(diǎn)偏內(nèi)側(cè)、跨越水平轉(zhuǎn)頭平均離心半徑（average radius，R_av）的位置。濾膜工作中所處的離心力場(chǎng)相對(duì)強(qiáng)度（Relative Centrifugal Field, RCF）與轉(zhuǎn)頭Rav所在位置對(duì)應(yīng)的RCF平均值（RCF_av）大小接近，但小于轉(zhuǎn)頭R_max處的最大RCF值(RCF_max)。以Himac 4×50mL錐形管水平轉(zhuǎn)頭R-8S為例，其RCF_max為11500xg，是平均半徑處RCF_av值的1.46倍，遠(yuǎn)大于濾膜所處位置的實(shí)際RCF強(qiáng)度。

       可見，水平轉(zhuǎn)頭標(biāo)示的RCF_max達(dá)到超濾離心管工作的RCF設(shè)置值，并不等于轉(zhuǎn)頭的有效RCF輸出達(dá)到超濾管最佳表現(xiàn)所需工作條件。只有轉(zhuǎn)頭的RCF_av達(dá)標(biāo)，轉(zhuǎn)頭RCF輸出性能才視為與濾膜理想工作狀態(tài)所需RCF強(qiáng)度相匹配。

       Beckman Allegra 25R離心機(jī)的4×500mL水平轉(zhuǎn)頭TS-5.1-500，可配置50mL錐形管 (30×120 mm)適配器、15mL 錐形管(17×120 mm)適配器，是超濾離心管使用指南中披露的轉(zhuǎn)頭選項(xiàng)之一。

表2. TS-5.1-500水平轉(zhuǎn)頭不同轉(zhuǎn)速下RCF輸出值

        數(shù)據(jù)顯示，4000×g RCF的設(shè)定，TS-5.1-500轉(zhuǎn)頭對(duì)應(yīng)工作轉(zhuǎn)速為5080rpm，已直逼其額定最高轉(zhuǎn)速5100rpm的極限。

        Pall Macrosep Advance的50mL超濾管RCF建議值為5000×g，已遠(yuǎn)超TS-5.1-500轉(zhuǎn)頭RCF_av輸出能力范圍。顯然，TS-5.1-500轉(zhuǎn)頭并不適用于Pall Macrosep Advance超濾管，而適用于Vivaspin 20、Vivaspin 6、Vivaspin Turbo 15、Vivaspin Turbo 4和Amicon Ultra-15。

       這提醒我們：并非所有配置有50mL、15mL錐形管適配器的水平轉(zhuǎn)頭都能適應(yīng)上述超濾離心管工作所需的RCF輸出要求。

       角轉(zhuǎn)頭則不同，其額定轉(zhuǎn)速通常高達(dá)8500rpm以上，可輕松實(shí)現(xiàn)RCF_av 5000×g的輸出目標(biāo)，對(duì)各品牌超濾離心管工作適應(yīng)性要優(yōu)于水平轉(zhuǎn)頭。

三、超濾純化濃縮實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)轉(zhuǎn)頭選型的解決方案

       根據(jù)RCF計(jì)算公式可知：

⑴相同離心半徑下，工作轉(zhuǎn)速相同則RCF相同；

⑵增加轉(zhuǎn)速可加大RCF輸出；

⑶更大的離心半徑，可實(shí)現(xiàn)相同轉(zhuǎn)速下更高RCF輸出。

       將RCF_av輸出值規(guī)定為4000×g，可計(jì)算出不同額定轉(zhuǎn)速的轉(zhuǎn)頭對(duì)應(yīng)的平均離心半徑值（R_av）。在此基礎(chǔ)上，以Falcon 50mL錐形離心管、15mL錐形離心管各自管身長(zhǎng)度的一半，即51 mm、55 mm，分別“嫁接”到水平轉(zhuǎn)頭的平均離心半徑上（計(jì)算原理同樣適用于角轉(zhuǎn)頭，限于本文篇幅，在此不予討論），即可得出這兩種標(biāo)準(zhǔn)尺寸超濾離心管適用水平轉(zhuǎn)頭最大離心半徑值（R_max）。

表3. 超濾離心管4000×g離心水平轉(zhuǎn)頭最大離心半徑(R_max)表

       水平轉(zhuǎn)頭工作性能與超濾離心管工作要求匹配程度評(píng)估方法是：

       第一步，根據(jù)實(shí)際所用轉(zhuǎn)頭的額定轉(zhuǎn)速值，找到表中該轉(zhuǎn)速對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)頭R_max計(jì)算值；

       第二步，將查到的R_max計(jì)算值與離心機(jī)制造商樣本資料中該轉(zhuǎn)頭R_max實(shí)際值比較。

       第三部，如轉(zhuǎn)頭的R_max實(shí)際值大于等于R_max計(jì)算值，則該轉(zhuǎn)頭滿足該超濾管所需理想工作條件。否則，則視為該轉(zhuǎn)頭性能無法確保超濾管工作表現(xiàn)處于最佳狀態(tài)，不建議使用。

       驗(yàn)證實(shí)例1：TS-5.1-500 水平轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速5100 rpm，R_max 190mm大于50mL超濾管離心對(duì)應(yīng)的RCF_av值189 mm，故TS-5.1-500滿足此超濾管4000×g的工作要求。

       驗(yàn)證實(shí)例2：Sorvall Legend RT Plus離心機(jī)TTH-750水平轉(zhuǎn)頭，最高轉(zhuǎn)速4600rpm，R_max 192 mm。表中與4600rpm轉(zhuǎn)速對(duì)應(yīng)的50mL超濾管Rmax計(jì)算值為220 mm。R_max實(shí)際值與計(jì)算值相差過于懸殊。故TTH-750水平轉(zhuǎn)頭無法與4000×g的RCF離心要求匹配。不單TTH-750如此，TX-1000（4×750mL/4200rpm/ R_max 209mm）、TX-740（4×750mL/4700rpm/ R_max 195mm）和TX-400（4×750mL/5000rpm/R_max 168mm）均不適用于此規(guī)格管工作RCF最佳條件要求。

       表3數(shù)據(jù)表明，凡不能適應(yīng)50mL超濾離心管工作要求的轉(zhuǎn)頭，亦無法作為15mL超濾管最適工作條件的選項(xiàng)。

       基于以上分析，表4中列出了可用于50mL超濾離心管4000×g工作要求的部分離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭。

表4. 部分50mL超濾離心管適用的離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭

四、結(jié)語(yǔ)

       離心力（centrifugation force）與樣品粒子自身質(zhì)量、某一時(shí)刻其所處位置的離心半徑和轉(zhuǎn)頭角速度的平方成正比。樣品溶液中不同分子量的分子、顆粒等，如質(zhì)量大小存在差異，即便所處離心半徑相同，所受的離心力大小也不相同。同種質(zhì)量組分，處于管內(nèi)不同離心半徑的位置，所受離心力也存在差異。因此，離心力的討論永遠(yuǎn)繞不開粒子質(zhì)量大小這一因素。

       物體在重力場(chǎng)中承受重力。而在轉(zhuǎn)動(dòng)的離心機(jī)轉(zhuǎn)頭內(nèi)，微觀粒子還同時(shí)置身于離心力場(chǎng)（centrifugation field）環(huán)境中。將某一時(shí)刻粒子所受離心力與重力的比值定義為離心力相對(duì)于重力的相對(duì)大小，即“相對(duì)離心力大小”（relative centrifugation force）后，則相對(duì)離心力大小與粒子種類、形狀、質(zhì)量大小都不再存在聯(lián)系，只與轉(zhuǎn)頭工作的角速度和粒子在轉(zhuǎn)頭中的離心半徑有關(guān)。在離心機(jī)專業(yè)技術(shù)資料中，習(xí)慣上用離心力場(chǎng)對(duì)重力場(chǎng)的相對(duì)強(qiáng)度，即相對(duì)離心力場(chǎng)強(qiáng)度（relative centrifugation field, RCF）來表征所有種類的微觀粒子所承受的相對(duì)離心力的大小，并指定用縮寫“RCF”（單位為×g）予以表述。

       驅(qū)動(dòng)超濾離心管內(nèi)樣品組分、粒子運(yùn)動(dòng)的有效RCF是粒子所在位置的實(shí)際RCF大小。粒子運(yùn)動(dòng)在轉(zhuǎn)頭內(nèi)不同離心半徑部位時(shí)，所處RCF環(huán)境不同，運(yùn)動(dòng)狀態(tài)也不同。不同的轉(zhuǎn)頭類型、不同轉(zhuǎn)頭的RCF_max值大小可能接近，但實(shí)際有效RCF輸出則大相徑庭。因此，在科學(xué)出版物中，標(biāo)明實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)頭型號(hào)（讀者據(jù)此便可查找到轉(zhuǎn)頭的R_max、K因子、最高轉(zhuǎn)速及RCF_max值）、轉(zhuǎn)速和平均離心半徑（R_av），要比簡(jiǎn)單、籠統(tǒng)地披露一個(gè)RCF數(shù)值，對(duì)同行更具有參考價(jià)值（因?yàn)楦鶕?jù)轉(zhuǎn)速和R_av值，可計(jì)算出轉(zhuǎn)頭的RCF_av，還能驗(yàn)證參考文獻(xiàn)所提供RCF值的有效性）。

        就超濾離心應(yīng)用而言，用轉(zhuǎn)頭的RCF_max來衡量超濾離心管的實(shí)際工作效能，技術(shù)上不可取。RCF_av值可更準(zhǔn)確反映管內(nèi)樣品實(shí)際所受離心力作用大小?？疾焯囟ㄞD(zhuǎn)頭是否有助于特定超濾離心管實(shí)現(xiàn)最佳工作性能，一個(gè)簡(jiǎn)單有效的指標(biāo)便是RCF_av。

       多年來的業(yè)內(nèi)外超濾離心實(shí)踐表明，要充分發(fā)揮超濾離心管工作效能，遵循超濾管說明書建議的工作條件是完全必要。而從目前看，超濾管離心的最適RCF要求，與多數(shù)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)所配置水平轉(zhuǎn)頭工作性能間存在著錯(cuò)位。對(duì)現(xiàn)成的離心機(jī)轉(zhuǎn)頭配置，不加詳查，貿(mào)然“就地取材”實(shí)施操作，極有可能偏離超濾管最佳離心條件。這一點(diǎn)，在水平轉(zhuǎn)頭中尤其須引起重視。

       角轉(zhuǎn)頭的優(yōu)勢(shì)在于其額定轉(zhuǎn)速具有很高冗余度，可通過調(diào)節(jié)工作轉(zhuǎn)速實(shí)現(xiàn)2000 -10000×g超寬范圍的RCF_av輸出，足以覆蓋各品牌、規(guī)格的超濾離心管工作所需RCF設(shè)置范圍。因此，為F15-6x100y、F-34-6-38、F0685、JA-18這類中等容量甚至大容量JLA-16.250、R12A3高速角轉(zhuǎn)頭配置50mL、15mL錐形管適配器，或采用F13-14x50cy、FA-45-6-30、C0650、JA-14.50、R15A及18A這類錐心管專用角轉(zhuǎn)頭，可為綜合型實(shí)驗(yàn)平臺(tái)帶來應(yīng)用范圍的充分可擴(kuò)展性和靈活性。

參考文獻(xiàn)

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Vivaspin Turbo 4 and 15 Technical data and operating instructions (Sartouris)

Cytiav Vivaspin 500_2_6 and 20 Instructions for Use

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Instructions For Use JA-14.50 Fixed-Angle Rotor (PN B32164AC)

R8S Swing Rotor for Refrigerated Centrifuge Instruction Manual (S99806208)