本文從水汽蒸發(fā)的規(guī)律出發(fā)，探討了超微量紫外可見分光光度計類儀器實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的測試誤差、穩(wěn)定性問題產(chǎn)生的可能原因，并從測試樣品體積調(diào)整、移液器的選擇和點樣操作時間控制三個方面提供了建議。

一、自然界水汽蒸發(fā)的基本規(guī)律

       自然界，液態(tài)的水從液面、固體表面轉(zhuǎn)變成氣態(tài)并擴散進入大氣的過程，稱為水的蒸發(fā)^[1]。我國學(xué)者綜合了蒸發(fā)面的飽和蒸汽壓差、水面風(fēng)速、空氣相對濕度和環(huán)境氣溫4個主要影響因素后，在描述水蒸發(fā)規(guī)律的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀罓栴D公式基礎(chǔ)上，建立了自由水面蒸發(fā)速率（或水日蒸發(fā)量，用E表示）的計算公式 ^[2]，即。

E = (e₀- e₁₅₀) ? f(W) ? [c + d(1-U²)^0.5] ? f(T₀-T₁₅₀)

       水面蒸發(fā)速率的單位為mm/d。1mm/d代表單位面積上的日蒸發(fā)液體高度為1mm。

       其中：

       水汽壓是指空氣中汽態(tài)水的分壓強。飽和水汽壓則是指在一定溫度下、一定體積空氣中，水汽達到最大限度含量時的分壓強。溫度升高，能使原已處于飽和狀態(tài)的空氣變得不飽和，還能進一步容納更多的水汽，蒸發(fā)面上的蒸發(fā)重新出現(xiàn)，則飽和水汽壓因而隨之增大。e₀指水面飽和水汽壓強，e₁₅₀代表水面上方150cm高度空氣的飽和水汽壓強。二者之差（e₀- e₁₅₀）為飽和水汽壓差。飽和水汽壓差越大，蒸面發(fā)面上蒸發(fā)作用越強。

       f(W)為風(fēng)速函數(shù)，W代表水面上空150 cm 處風(fēng)速。水面風(fēng)速可加快空氣中水汽的擴散和輸送，使水分子更容易逸出水面，蒸發(fā)加快。風(fēng)速大，即f(W)值大。

       U為空氣相對濕度，是某一溫度下空氣中的實際水汽壓與該溫度下空氣飽和水汽壓的比值。相對濕度較小時，水汽向外擴散和交換較快，蒸發(fā)作用較強。

       f(T₀-T₁₅₀)為溫度函數(shù)，T₀、T₁₅₀分別指代水面、水面上方150 cm高處的氣溫。通常，水體溫度升高并高于T₁₅₀會加大蒸發(fā)速率。

       由道爾頓蒸發(fā)定律可知，水面上方空氣相對濕度小、水面風(fēng)速大、水體溫度高，可增大自由水面水蒸發(fā)率。這在用氮氣吹掃儀進行樣品濃縮時很容易體驗到：增大高純度干燥氮氣流量、采用加熱模式可增加水等溶劑的蒸發(fā)速率，提高樣品濃縮效率。而PCR、實時熒光定量PCR實驗中則特別注意反應(yīng)孔的密封。因反應(yīng)體系水分蒸發(fā)，將造成樣品孔內(nèi)反應(yīng)組分濃度失衡，會破壞各孔擴增均一性，甚至使PCR失敗。

       不同地域和季節(jié)，實驗室的室溫、通風(fēng)對流條件、空氣相對濕度不同，水汽蒸發(fā)對實驗樣品影響的直觀程度不一。

       譬如，蛋白凝膠、轉(zhuǎn)印膜、新鮮組織等樣品長時間直接暴露于空氣中，水分大量蒸發(fā)對實驗潛在危害的防范意識已深入人心，人們通常會采取保濕保鮮處理措施應(yīng)對。微量紫外可見光度測試操作中，上樣體積通常不過數(shù)微升，點樣后放下檢測臂，20秒時間不到即可自動完成測定和結(jié)果顯示，操作簡單便捷，并不存在可影響到樣品測試精度和穩(wěn)定性的繁文縟節(jié)。其實，微量紫外測定操作與水分蒸發(fā)之間，看似微不足道，實則關(guān)系重大。                                              

       NanoDrop類微量光度計與NanoPhotometer N60超微量紫外可見光度計對體積2.0μL以下樣品常規(guī)濃度樣品測試光路生成所用方法完全不同（詳情可參考《Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計隆重上線》）。美國NanoDrop為代表的微量紫外分光光度計的測試光路的形成及有效維持取決于兩個關(guān)鍵因素：一是疏水性石英光學(xué)表面對樣品的低吸附性，二是樣品中水的表面張力作用。此二者共同作用可確保滴加到檢測窗表面的液滴自動收縮形成飽滿圓珠。一旦光學(xué)表明因樣品污漬、鹽分、表面活性劑等殘留，點樣后液體無法形成半球型微珠，測試系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性將不復(fù)存在。

       而液體圓珠的生成后，隨之而來便是水汽蒸發(fā)與樣品濃縮的問題。

二、超微量紫外可見光度計測定中的樣品濃縮問題

       比表面積（specific surface area）是指物體表面總面積與其體積之比值。

       在材料科學(xué)、化學(xué)工程等領(lǐng)域，通常，粒子越細，比表面積（習(xí)慣上用單位質(zhì)量物料所具有的總表面積標(biāo)示，單位m2/g）越大。粒子物化活性，如氧化、溶解、蒸發(fā)、催化以及生理效應(yīng)等都因細粒子比表面積大而加速。生物學(xué)中，細胞的比表面積影響細胞物質(zhì)交換和代謝功能。小細胞通常具有較高的比表面積值，它們能夠更有效地從外部環(huán)境中攝取所需的養(yǎng)分并排出廢物。

       根據(jù)幾何學(xué)常識，在體積相同條件下，與圓柱體、橢球體、正方體比，球體的表面積是最小的，因而球體的比表面積也最小。

       自然界中，露珠一般形成于溫濕度適宜、晴朗無風(fēng)或微風(fēng)的夜晚，而隨著清晨氣溫升高和氣流攜帶水汽加速擴散作用，很快會因蒸發(fā)而消失。因所附著物體表面及位置不同，露珠往往呈球形、半球型或水滴狀。

       球體體積=4πR3/3，故半球體的體積為2πR3/3。

       球體表面積=4πR2 ，則半球體的曲面部分的面積＝2πR2。

       將半球體的曲面表面積與半球體積（露珠或超微量測試樣品的容積）的比值視為半球體比表面積（等效于單位體積液體所占曲面表面積，單位為m2/μL），該比值=3/R，它與半球半徑成反比。液體體積增加，半球直徑加大，半球曲面比表面積降低。

表1 半球體積-半徑-曲面比表面積表

       譬如，半球體積（相當(dāng)于露珠或測試溶液體積）從2.0μL增加至4.0μL時，半球半徑增至原來的1.26倍，而半球曲面比表面積反而降至原來的0.79倍。

       將表1中半球球體體積(x軸)與曲面比表面積（y軸）作圖可得到半球曲面比表面積隨半球體積變化曲線。圖3中，比表面積曲線在0.5 – 2.0μL體積區(qū)間呈現(xiàn)為急劇俯沖下降段，2.0μL是一個轉(zhuǎn)折點，此后的曲線相對平緩，其中2.0μL – 5.0μL體積區(qū)間下滑坡度略大，5.0 – 10.0μL體積區(qū)間比表面積降幅收窄、降速減弱。

       水溶液直接暴露于空氣中，存在水分蒸發(fā)問題。在自由水面，蒸發(fā)速率相同條件下，半球體積大，半球曲面總表面積大，則相同時間內(nèi)因蒸發(fā)損耗的水汽絕對體積固然更大。但曲面比表面積曲線則告訴人們：半球體積較小，曲面比表面積反而較大，則相同時長內(nèi)液體蒸發(fā)速率更高，單位體積液體的濃縮作用越明顯。因此，存在這樣一種事實：半球形液體體積少——單體液體曲面比表面積大——單位體積蒸發(fā)速率大——單位體積液體蒸發(fā)量大——溶液濃縮效應(yīng)大。簡單概況起來就是，半球體積小，液體濃縮程度大。

       測試樣品因水汽蒸發(fā)所致濃縮效應(yīng)對測試結(jié)果的影響，在常規(guī)比色皿測定中可能不明顯，但對于NannoDrop One C這類超微量紫外可見光度計，單樣品上樣體積僅2μL的測試操作，濃縮效應(yīng)對測試結(jié)果的影響清醒則蔚為壯觀。而為減少小體積樣品測試結(jié)果因水汽蒸發(fā)樣品濃縮所致測試誤差，適度增加上樣體積不失為一個有效應(yīng)對方案。

       從圖3看，2.0μL – 5.0μL體積區(qū)間具有較高效（比表面積）費（樣品消耗體積）比。相對而言，5.0μL – 6.0μL體積較2.0μL更理想。故有業(yè)內(nèi)資深人士吳鐵坤先生曾建議，NannoDrop系統(tǒng)單個測試樣品的點樣體積以5.0μL為宜，看來頗有見地。

       NannoDropOne C代表的微量紫外可見光度計的測試光學(xué)原理基本一致，即點樣后在檢測基座和檢測臂光學(xué)表面半球形液滴轉(zhuǎn)變?yōu)橐粭l垂直液柱，測試光路從液柱的中軸穿過來對樣品檢測。NannoDropOne的測試光程介于0.030 - 1.0 mm之間。而從表1可知，0.5μL - 2.0μL體積樣品的半徑介于0.62 - 0.98mm之間，當(dāng)測試光程為1.0mm時，液滴由半球體被輕度拉伸為垂直液柱并且在8秒鐘測試期間維持不變。因半球體轉(zhuǎn)換為柱體后，液體表面積增大的同時水汽蒸發(fā)速率隨之增加。

       而點樣體積達到3.0μL后，液滴半徑增至1.13mm以上，其自然半徑和高度足以充滿上下光學(xué)界面空間。檢測臂放下后無需拉伸液滴即可自然形成穩(wěn)定有效的檢測光路。此時，液體呈不規(guī)則半球體狀（近似于橢球體），曲面比表面積值變動程度細微到可以忽略，故樣品在測讀期間，水汽蒸發(fā)速率依然維持在較低水平，濃縮問題得以較好控制。

       正是基于降低此類型儀器平臺測試運行期間樣品水汽蒸發(fā)的考慮，為確保測試運行可靠穩(wěn)定，微量紫外可見光度計對測試環(huán)境的溫度（5 – 35℃）、空氣相對濕度（20-80% R.H.）、通風(fēng)氣流條件都有要求。譬如，NannoDropOne C操作指南規(guī)定：1）儀器置于遠離通風(fēng)口和排氣風(fēng)扇的位置以便有效減少樣品水汽蒸發(fā)；2）在建議的環(huán)境濕度范圍下運行時，應(yīng)確保上樣體積足量，確保正確的液柱形成，以免蒸發(fā)劇烈干擾測試 ^[3]。

三、微量紫外可見分光光度計測定中移液器的合理選型

       正所謂量變引起質(zhì)變的道理，當(dāng)樣品體積的量變達到一定限度后，與測試有關(guān)的各種內(nèi)外矛盾就會發(fā)生質(zhì)變而對測試精準(zhǔn)性產(chǎn)生制約。

       紫外可見光度檢測的測試光程從標(biāo)準(zhǔn)10mm降至0.03-1.0mm后，測試樣品體積驟減至2.0μL。此時，測試環(huán)境因素和內(nèi)部水汽蒸發(fā)規(guī)律共同作用下，樣品體積的改變就對測試結(jié)果有決定性影響力。因不同體積測試過程對水汽蒸發(fā)引起的樣品濃縮作用抵抗力不同，確保上樣體積的精準(zhǔn)、穩(wěn)定控制的同時，減少測試操作期間樣品水汽蒸發(fā)損耗，就成為微量樣品檢測中技術(shù)關(guān)鍵問題。

3.1  移液器上樣精度的控制

       NannoDropOne C微量紫外可見光度計的單個樣品測試體積可低至0.5–2.0μL。移液器系統(tǒng)固有移液誤差、手工點樣操作誤差的疊加，每個測試樣品的實際上樣體積存在差異是難免的，點樣后至儀器自動測讀期間樣品因水汽蒸發(fā)量不同，樣品的濃縮程度不一，造成樣品測試穩(wěn)定性、精準(zhǔn)度下降，測試結(jié)果波動。因此，在樣品體積許可情況下，一方面應(yīng)盡可能增加單個樣品的上樣體積，降低樣品水蒸發(fā)速率，減緩因液體濃縮對測試結(jié)果的干擾。另一方面，為精確移取2.0-5.0μL樣品，采用與測試體積匹配的移液量程，并盡量選擇高精度、高穩(wěn)定性的電動或手動移液器執(zhí)行移液操作。

表2  eppendorf Research Plus單道移液器移液精準(zhǔn)度表

       從Research Plus系列單道移液器移液精準(zhǔn)度數(shù)據(jù)看，移取2μL純水時移液誤差，0.1–2.5μL移液器與0.5–10μL移液器性能接近（約±2.0%），要遠優(yōu)于另兩款2–20μL移液器（誤差±5.0%）。這說明，0.1–2.5μL與0.5–10μL兩款移液器與原廠高品質(zhì)吸頭組合情況下的移液精度，可以滿足NanoDrop OneC、Nanodrop lite Plus、L-SP-A、L-SP-B、Unano-1000和Nano-300微量紫外可見分光光度計的測試要求。這與Nanodrop用戶指南的要求一致。Research plus系列0.5 - 10μL 8道可調(diào)量程移液器移取2.0μL提及的誤差低于5.0%，與NanoDrop Eight、Aurora-8000八道微量紫外可見分光光度計測定要求是匹配的。

       就現(xiàn)有的技術(shù)資料看，并非所有品牌移液器移液精度和誤差范圍達到上述微量紫外可見光度計穩(wěn)定可靠測定的要求。因此，移液器的選擇，是確保超微量樣品紫外光度測定穩(wěn)定性和測試精度的重要一環(huán)。

3.2 點樣操作時間控制

       如前所述，在水面蒸發(fā)速率相對穩(wěn)定條件下，相同體積的半球形液滴，測試期間的水汽蒸發(fā)總量與蒸發(fā)時間相關(guān)。點樣后暴露過程和測讀耗時長，水汽蒸發(fā)量大，則樣品測試誤差大，數(shù)據(jù)可重復(fù)性、穩(wěn)定性低。

       誠如《Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計隆重上線》文中所言，由于NanoDrop OneC（0.03mm/0.05mm/0.1mm/0.2mm/1.0mm五擋光程）、L-SP-HB（0.02mm/0.05mm/0.2mm/1.0mm三擋光程）和Unano-1000（1nm/0.2nm/0.05mm 三擋光程)、Nano300（0.2mm/1.0mm雙光程）等不同微量紫外光度計所設(shè)置的測試光程檔數(shù)不一，單個樣品完成全部光程掃描所需時長不同，樣品測試時長不同，這意味著相同體積樣品在不同機型上測試期間，水汽蒸發(fā)總量事實上存在著差異。

       此外，從實驗操作而言，在完成精細移液點樣后，應(yīng)立即放下檢測臂啟動樣品測讀，以縮短樣品在檢測窗暴露時的水汽自由蒸發(fā)時間，降低測試誤差。而這對于樣品測讀時間較長的機型具有實實在在的意義。

       有研究人員曾反映， NanoDrop One單道微量紫外光度計測定核酸樣品的讀數(shù)誤差很大，分析主要原因是傳統(tǒng)單道手動移液器的移液精度和穩(wěn)定性差，批內(nèi)樣品點樣體積波動過大所致。故對于實時熒光定量PCR檢測中核酸模板濃度和品質(zhì)評估，提出在8通道NanoDrop Eight測試平臺上、并采用8通道高精度移液器執(zhí)行批量點樣操作，有望提高qPCR測試數(shù)據(jù)精準(zhǔn)性和可靠性。

       因此，單通道精密移液器用于執(zhí)行單通道微量紫外光度計的點樣操作十分理想，但不適用于NanoDrop Eight、Aurora-8000及NanoPhotometer N120這類多通道微量紫外可見光度計采用。因為采用單道移液器逐個檢測位點依次點樣操作，造成檢測窗上第一個與最末一個樣品在點樣后水汽自由蒸發(fā)時長上差異懸殊，認(rèn)為加大了同批次樣品測試結(jié)果的誤差?？蛇x擇0.5–10μL量程可調(diào)的Xplorer plus、Research plus這類多道電動或手動移液器，一次性完成多個樣品同步操作，可避免因水汽蒸發(fā)時長不同因素加大測試誤差，有利于獲得高精準(zhǔn)的測試結(jié)果。

【參考文獻】

[1]申德裕.介紹計算水面蒸發(fā)量的幾種方法. 水利信息化，1996, (4) : 24-28

[2]毛海濤, 王正成, 王曉菊, 等. 北疆平原水庫水面蒸發(fā)模型的建立與關(guān)鍵參數(shù)確定. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2018, 34(6): 129-136.

[3] NanoDrop微紫外/可見光分光光度計用戶手冊（Revision B）