（前續(xù)：Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在細(xì)胞外囊泡離心分離中的應(yīng)用） 

三、Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在核糖體分離中的應(yīng)用

       核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成場所, 遍布于原核、真核生物的細(xì)胞質(zhì), 真核生物細(xì)胞線粒體和植物細(xì)胞葉綠體中。生長旺盛的大腸桿菌胞體內(nèi)約2.0 萬個(gè)核糖體, 約占細(xì)胞總重量的1/4。真核生物細(xì)胞中的核糖體不僅數(shù)量多（為細(xì)菌內(nèi)核糖體顆粒數(shù)量的50倍）, 其體積更大。核糖體體積小, 直徑20-30nm, 借助于電子顯微鏡技術(shù)才實(shí)現(xiàn)可視化。其最早由美國洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所羅馬尼籍亞細(xì)胞生物學(xué)家帕拉德（G. E. Palade）發(fā)現(xiàn)并于1956年正式公布, 故在1958年被正式命名為核糖體（ribosome）前, 一度被稱為“帕拉德離子”。

       在帕拉德發(fā)現(xiàn)核糖體并發(fā)明蔗糖密度梯度超速離心分析技術(shù)后不久, 人們就認(rèn)識(shí)到核糖體提取緩沖液中的鎂離子濃度的大小不同, 得到的核糖體產(chǎn)物不同。鎂離子濃度較高時(shí)得到的是沉降系數(shù)（sedimentation coefficient）為70S細(xì)菌完整核糖體；而鎂離子濃度降低時(shí)得到是沉降系數(shù)分別為30S 和50S的兩個(gè)大小不同的核糖體亞基。從發(fā)現(xiàn)核糖體到基本弄清核糖體蛋白質(zhì)合成的精細(xì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)前, 用70S指代核糖體, 以50S、30S分別命名一大一小兩個(gè)亞基的做法就一直沿用至今?？梢? 超速離心技術(shù)的應(yīng)用在核糖體早期研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。不同種屬、不同胞內(nèi)定位的核糖體, 根據(jù)沉降系數(shù)的大小, 主要分為55S核糖體、70S及80S核糖體三大類。其中, 原核和類似原核細(xì)胞的70S核糖體由50 S 大亞基和30 S 小亞基組成, 真核細(xì)胞80 S 核糖體由60 S 大亞基和40 S 小亞基組成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體內(nèi)55S核糖體（mitoribosome）由28S和39S兩個(gè)亞基組成。

       要討論超速離心分離核糖體, 就繞不開前人已給出的沉降系數(shù)值。

       沉降系數(shù)是人們用于描述生物大分子（如核酸、蛋白）和一些大分子復(fù)合物（如核糖體、核糖體亞基）在特定液體溶液中離心沉降速度的參數(shù)。將樣品分子視作外具有一定直徑在超速離心力作用下的運(yùn)動(dòng)質(zhì)點(diǎn)。質(zhì)點(diǎn)在離心力和浮力作用下加速運(yùn)動(dòng), 離心力減去浮力為分子顆粒所受的凈離心力, 即：

F = m·ω ²·r  ····················(1)

      樣品顆粒直徑假為d（單位：cm）, 顆粒密度為σ, 顆粒自身體積為V, 溶液密度為ρ, 則質(zhì)點(diǎn)在離心力和浮力作用下加速運(yùn)動(dòng)所受的凈離心力F =  V·(σ ? ρ ) ·ω ²·r  ····················(2)

      顆粒以沉降速度ν在溶液中運(yùn)動(dòng), 所受的流體反向摩擦阻力為f, 根據(jù)粘性流體力學(xué)的stokes 定理有：

f = 3π·d·η·ν  ····················(3)

      當(dāng)水平方向上的凈離心力與液流摩擦阻力達(dá)到平衡時(shí), 則顆粒以勻速在溶液中沉降。此時(shí)F = f, 即：

F1 = V·(σ ? ρ ) ·ω ²·r = f = 3π·d·η·ν  ····················(4)

      球體體積計(jì)算公式V =  (4/3) ?π?(d/2)3 = （π/6）?d3····················(5)

      公式4和5簡化可得到顆粒在溶液中沉降速度ν的計(jì)算公式：

ν = (d²/18) ?［(σ - ρ)/η］?ω ²·r  ····················(6)

      可見, 外形規(guī)則的球形顆粒在粘度為η、密度為ρ的溶液中勻速運(yùn)動(dòng)速率大小與顆粒自身、密度大小、所受離心力大小有關(guān)。

      而根據(jù)公式2、5和6, 可得到以下公式：

ν/F =  (d²/18) ?［(σ - ρ)/η］  ····················(7)

      公式7中的ν/F, 即樣品顆粒在單位離心力作用下的勻速沉降速度。當(dāng)樣品溶液條件一致時(shí), 每單位離心力下顆粒沉降速度大小與顆粒直徑、密度有關(guān)。將顆粒在單位離心力作用下移動(dòng)速度視為樣品離心運(yùn)動(dòng)屬性, 定義為樣品顆粒的離心沉降系數(shù)。由于顆粒直徑很小, ν/F比值一般為10-13數(shù)量級(jí)。多數(shù)生物大分子的比值在10-13至10-13量級(jí)。 因沉降系數(shù)的概念由瑞典科學(xué)西奧多·斯維德伯格(Theodor Svedberg)在1924年提出。為紀(jì)念這一超速離心技術(shù)方法創(chuàng)立者, 沉降系數(shù)的數(shù)量單位被規(guī)定為S。1 S = 10-13（秒）。蛋白的沉降系數(shù)在1-20S之間, 核酸的沉降系數(shù)在5-100S 之間。

      將沉降系數(shù)的概念應(yīng)用于公式6后可知, 樣品的沉降速度與沉降系數(shù)、離心力大小有關(guān)。樣品溶液、轉(zhuǎn)頭及轉(zhuǎn)速條件相同的情況下, 樣品組分的沉降系數(shù)大, 則沉降速度快。

      原核生物的70S核糖體由50S大亞基及30S小亞基組成。當(dāng)提取液中同時(shí)含有這三種組分時(shí), 無論是在核糖體提取緩沖液或連續(xù)蔗糖密度梯度液中, 70S核糖體的沉降速度都將大于兩個(gè)亞基的速度。在提取緩沖液超速離心階段, 首先沉淀的是70S。延長離心時(shí)間, 則依次是50S、30S亞基沉淀。因此, 利用核糖體及各組分沉淀時(shí)間上的差異, 可在同一份樣品中將核糖體與其組成亞基分離。但同時(shí)須注意：離心時(shí)間過長, 樣品中沉降系數(shù)為50S - 70S的（囊泡類）組分發(fā)生沉淀富集, 會(huì)帶來污染。

3.1 原核生物核糖體分離

實(shí)例1. 痤瘡角質(zhì)桿菌70S核糖體的制備（Ivan B Lomakin, 2023）

      核糖體基因序列盡管高度保守, 但不同菌種間存在廣泛結(jié)構(gòu)差異。開發(fā)更具病原體物種特異性核糖體靶向窄譜抗菌藥物有助于避免許多靶向核糖體的抗生素大多數(shù)具有廣譜抗菌活性對(duì)人體微生物組的破壞。

      研究顯示, 在痤瘡梭菌核糖體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白bS22和bL37, 不僅確保了核糖體結(jié)構(gòu)完整性, 還可以穿透細(xì)菌細(xì)胞壁并抑制蛋白質(zhì)合成, 可以作為細(xì)菌素抑制革蘭氏陽性表皮鏈球菌和病原體金黃色葡萄球菌的生長。其中的bS22只抑制革蘭氏陰性大腸桿菌的生長。

      第三代四環(huán)素類窄譜抗生素沙雷環(huán)素(Sarecycline, SAR)對(duì)包括痤瘡梭菌在內(nèi)的一些革蘭氏陽性細(xì)菌具有抑菌活性。但借助于冷凍電鏡研究發(fā)現(xiàn), SAR可能抑制痤瘡角質(zhì)桿菌70S核糖體的兩個(gè)活性位點(diǎn)。SAR除30S亞基中mRNA decoding center的經(jīng)典抗菌結(jié)合位點(diǎn)外結(jié)合外, 50S亞基活性中心的第二SAR結(jié)合位點(diǎn)。SAR通過結(jié)合兩個(gè)的核糖體中心/活性位點(diǎn), 發(fā)揮痤瘡梭菌抗菌功效和低耐藥性。因此, 通過進(jìn)一步優(yōu)化SAR在70S核糖體的靶位, 抑制痤瘡梭菌的同時(shí), 發(fā)揮核糖體蛋白bS22和bL37的選擇性抑菌功效, 維持皮膚/毛囊皮脂腺單位微生物組的穩(wěn)態(tài)。

      痤瘡梭菌核糖體70S制備流程大致如下：

【細(xì)菌培養(yǎng)】

在厭氧條件下生長痤瘡角質(zhì)桿菌C. acnes.痤瘡梭菌細(xì)胞(ATCC 11827TM)根據(jù)ATCC指南(Microbiological CμLture Media: A Complete Guide for Pharmaceutical and Healthcare Manufacturers)在血瓊脂接觸板上重新激活和鋪板。將來自一個(gè)平板的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有2升腦心浸出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth，BHI)的6升燒瓶中, 并在搖床上37℃下100rpm振蕩培養(yǎng)40小時(shí)。

【菌體裂解】

5g菌體樣品懸浮在50mL緩沖液B中［20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 200mM KCl, 20mM MgAc, 1mM DTT, 1 mg/mL溶菌酶, 1片Roche復(fù)合蛋白酶抑制劑(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail)和100U的DNase I］；

用高壓均質(zhì)器中以15000 psi裂解3個(gè)周期后, 用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭4℃下18000rpm離心30 min, 收集上清；

【超離純化】

上清轉(zhuǎn)移至25mL蔗糖溶液(20mM HEPES-KOH, 500mM KCl, 20mM MgCL2, 1mM DTT, 1.1M sucrose)墊層上, 用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭4℃下42000rpm離心21小時(shí), 收集沉淀；

沉淀重懸于高鹽緩沖液［20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 10mM MgAc, 1mM DTT］中, 4℃下平緩振蕩孵育3小時(shí), 重復(fù)上一步的蔗糖溶液離心操作；

沉淀用高鹽緩沖液重懸, 轉(zhuǎn)移至蔗糖密度梯度溶液［20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 10–40% sucrose］墊層上, 用SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下20000rpm離心16小時(shí)；

【濃縮保存】

收集70S核糖體對(duì)應(yīng)的密度帶餾分,用Amicon離心濃縮濾柱(100KDa MWCO)濃縮；

將濃縮后的70S洗脫于核糖體緩沖液［20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT)中, 液氮保存。

實(shí)例2 金葡菌70S核糖體的制備流程（Iskander Khusainov, 2017）

【細(xì)菌培養(yǎng)】

在腦心浸出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth，BHI)中以37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)2L金葡菌RN6390, 在AD600 = 1.0 AU/mL時(shí)收獲菌體；

用10mM Tris–HCl/pH 7.5緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，4750×g離心沉淀細(xì)胞(典型產(chǎn)量是2L培養(yǎng)物得到4.5–5.0g濕重菌體細(xì)胞)；

【菌體裂解】

將沉淀重懸于30mL補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物、DNase I和3.5mg溶葡萄球菌素的緩沖液A［20mM HEPES-KOH/pH 7.5、100mM NH4Cl、21mM Mg(OAc)2、1mM EDTA、1mM DTT］中, 37℃下裂解45min（注：裂解處理方法未載明）；

30000×g離心90min除去細(xì)胞碎片；

在上清液中添加補(bǔ)充PEG 20000至最終個(gè)濃度2.8%(w/v)后, 10000×g離心5min，棄沉淀；

將上清液中PEG 20000濃度增加到4.2%(w/v)后，20000×g離心10min,棄上清收集（核糖體）沉淀；

【超離純化】

沉淀重懸于35mL緩沖液A中, 并移液至25mL蔗糖緩沖液墊層［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 25mM Mg(OAc)2, 1.1M sucrose, 0.5mM EDTA, 1mM DTT］上，用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭4℃下158420×g下離心15小時(shí)，收集沉淀；

將沉淀重懸于緩沖液E［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 100mM KCl, 10mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 1mM DTT］中。測定A260值，計(jì)算的蛋白濃度約7mg/mL。將0.5mL懸浮液移液至7–30%蔗糖密度梯度上,  用SW 28水平轉(zhuǎn)頭38694×g離心15.5小時(shí)；

【濃縮保存】

收集并將70S對(duì)應(yīng)餾分合并后, 調(diào)節(jié)Mg(OAc)2濃度至25 mM, 加入PEG 20000至終濃度為4.5%(w/v)，20000×g離心12min將核糖體沉淀（典型的產(chǎn)量是來自5g細(xì)胞的10-12mg核糖體）；

將沉淀溶解在緩沖液G［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 10mM Mg(OAc)2, 1mM DTT］中至終濃度為25-30mg/mL。分為30μL的等分經(jīng)液氮速凍后-80℃儲(chǔ)存。

實(shí)例3 大腸桿菌70S核糖體的制備流程（Liang Meng Wee, 2023）

【菌體裂解】

收集對(duì)數(shù)生長期(OD600 = 0.5)大腸桿菌MRE600(濕重約2.4g), 重懸于15mL添加cOmplete的裂解緩沖液［20mM Tris-HCl/pH 7.5, 100mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA和6mM β-ME)中；

用超聲細(xì)胞破碎儀50mL玻璃杯在冰上裂解細(xì)胞。輸出功率設(shè)置為8, 3×30秒脈沖, 30秒間隔)；

裂解液轉(zhuǎn)移至50ml Nalgene Oak Ridge管中, 在Avanti JXN-26離心機(jī)JA-20轉(zhuǎn)頭中4℃下16000rpm離心15min；

用5mL裂解緩沖液沖洗沉淀后, 將沖洗液、上清合并后，樣品總體積約27mL；

【超離純化】

轉(zhuǎn)移至35mL蔗糖溶液［20mM Tris-HCl/pH 7.5, 500mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME, 37.7%(w/v) sucrose］墊層上（在Beckman 70mL帶蓋透明超速離心瓶中制備）, 用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭4℃下33000rpm離心22小時(shí)；

棄上清, 將沉淀4℃下風(fēng)干10min后, 重懸于2mL緩沖液［10mM Tris-OAc/pH 7.5, 60mM NH4Cl, 7.5mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME］中, 4℃孵育2小時(shí)；

用梯度混合器（在open-top thick wall管 355642中）生成從上至下10–40% (w/v)的蔗糖連續(xù)密度梯度溶液(共6管)；

測定懸浮溶液的A260值, 計(jì)算核糖體的濃度相當(dāng)于85mg/mL；

將懸浮液再次轉(zhuǎn)移至蔗糖梯度溶液層墊上, 用SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下22000rpm離心17小時(shí)；

【濃縮保存】

從管底部開始, 監(jiān)測A260值, 以1.5mL/min流速收集樣品餾分；

收集和合并含70S核糖體餾分, 用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭4℃下45000rpm離心20小時(shí)，棄上清；

將沉淀4℃風(fēng)干10min后, 重懸于4℃梯度緩沖液中, 分成25μL等分, 液氮速凍后-80℃儲(chǔ)存。

實(shí)例4 嗜熱鏈球菌(T. thermophilus) 70S核糖體純化和核糖體復(fù)合體重構(gòu)（Alexey Rozov, 2015）

【菌體裂解】

所有操作均在4℃下進(jìn)行。

用1L緩沖液A(150mM MgCl2, 500mM NH4Cl, 40mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT)洗滌和重懸細(xì)胞(100g)；

重懸液中加入DNase(1U/mL)和PMSF(1μg/mL),用高壓均質(zhì)器裂解菌體；

30000×g離心30min除去菌體碎片；

【超離純化】

上清液轉(zhuǎn)移至1.5M 蔗糖緩沖液［1.5M sucrose, 0.68M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT］墊層上, 用SW 28水平轉(zhuǎn)頭100000×g離心20小時(shí)；

收集底部的5mL餾分, 用緩沖液B［50mM MgCl2, 150mM NH4Cl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na2, 1mM DTT］稀釋3次, 轉(zhuǎn)移至1.8M蔗糖緩沖液［1.8M sucrose, 0.8M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2］墊層上, 用SW 28水平轉(zhuǎn)頭100000×g離心40小時(shí)；

收集底部4 mL緩沖液餾分, 在緩沖液B中析。將4M (NH4)2SO4溶液加入透析液并調(diào)整其終濃度至1 M；

將透析液（按A260測定值計(jì)算，相當(dāng)于核糖體500mg)移至含1M(NH4)2SO4的緩沖液C［10mM MgCl2, 400mM NaCl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT］預(yù)平衡的200mL Toyopearl Butyl 650S蛋白純化柱上。用含0.8 M(NH4)2SO4的兩倍柱體體積的緩沖液C洗滌后，保持緩沖液C的其他組分恒定(流速6mL/min, 餾分體積12mL), 用900mL反向梯度(80-40%)的(NH4)2SO4洗脫。將(NH4)2SO4和MgCl2濃度分別調(diào)節(jié)至1 M和50 mM，在Toyopearl Butyl 650S純化柱中洗脫70S，檢測A260值收集70S核糖體峰；

將7S核糖體洗脫液用緩沖液D［10mM Mg(OAc)2, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 1mM DTT, 10mM HEPES/pH 7.5］中透析后，移至用緩沖液D制備的5–20%蔗糖梯度溶液墊層上, 用SW 28水平轉(zhuǎn)頭15400rpm離心17小時(shí)；

【濃縮保存】

收集并合并70S核糖體峰餾分, 用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭45000rpm超速離心過夜；

將沉淀重懸于稀釋的緩沖液D中（5mM HEPES/pH 7.5）（分成等分在液氮中快速冷凍并-80℃儲(chǔ)存或進(jìn)行下一步操作；

將70S核糖體(3μM)與過量的mRNA、3-5含量的tRNA在37℃、pH 7.0緩沖液［10mM Tris-乙酸鹽、40mM KCl、7.5mM Mg(OAc)2、0.5mM DTT］中一起孵育形成核糖體復(fù)合物。

3.2 真核生物細(xì)胞核糖體分離

實(shí)例5  酵母菌核糖體的制備（Liang Meng Wee, 2021）

【菌體裂解】

收獲生長到指數(shù)期的YAS2488酵母細(xì)胞，在液氮中冷凍, 用研缽和研杵研磨破碎菌體；

菌體粉末懸浮于裂解緩沖液［20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 1 mg/ml Heparin, 2mM DTT, 0.5mM AEBSF］中，4℃下18000×g離心10min，棄沉淀；

【超離純化】

收集上清并轉(zhuǎn)移至1.1M蔗糖緩沖緩液［20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 500mM KCl, 2mM DTT］墊層上, 用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭39000rpm離心5小時(shí)20min；

沉淀重懸于緩沖液［20mM HEPES-KOH, PH 7.4、50mM KCl、5mM Mg(OAc)2、0.1mM PMSF、0.1 mM benzamidine、2mM DTT］中, 轉(zhuǎn)移至10- 40%蔗糖梯度溶液墊層上, 用SW 32.1 Ti水平轉(zhuǎn)頭32000rpm 離心5小時(shí)；

【濃縮保存】

收集80S峰并將緩沖液交換至再結(jié)合緩沖液［3mM HEPES-KOH/pH 7.4, 6.6mM Tris-HOAc/pH 7.2), 3mM NH4Cl, 6.6mM NH4OAc, 48mM KOAc, 4mM Mg(OAc)2, 2.4mM DTT］；

純化的核糖體-80℃儲(chǔ)存。

3.3 核糖體亞基分離

實(shí)例6 從大腸桿菌MRE600中純化30S和50S核糖體亞基（Powers, T.，1991）

【細(xì)菌培養(yǎng)】

將含有100mg/L氨芐青霉素的500mL LB肉湯接種1ml飽和過夜培養(yǎng)物, 并在37℃下生長至A650 = 0.5。然后將培養(yǎng)物在冰上冷卻20min, 在4℃下用Sorvall GSA角轉(zhuǎn)頭8000rpm離心15min；

【菌體裂解】

將細(xì)胞洗滌并重懸于15mL緩沖液［50mM Tris-HCI(pH 7.6, 10mM MgCl 2 100mM NH4Cl, 6mM β-ME, 0.5mM EDTA］中，用高壓均質(zhì)器18000 psi下連續(xù)兩次裂解處理；

加入10μg的DNase I后, 用Sorvall SS34角轉(zhuǎn)頭(SS-34: 8×50 mL: Max. RCF 50228 xg/25000rpm)在4℃下15000rpm離心各15min兩次；

【超離純化】

裂解物中NH4C1調(diào)節(jié)至0.5 M, 在4℃下用Type 60 Ti角轉(zhuǎn)頭(8×38.5mL, Max. Speed 60000rpm)40000rp離心4小時(shí)；

將粗核糖體沉淀洗滌并重懸于1mL緩沖液［50mM Tris-HCI/pH 7.6, 6mM MgCl2, 100mM NH4CI, 6mM β-ME］中, 轉(zhuǎn)移至同一緩沖液中制成的40mL 10-40%(W/V)蔗糖梯度溶液上，用SW 28水平轉(zhuǎn)頭4℃下20000rpm離心13小時(shí)；

測定每個(gè)管中的A260值, 收集1mL餾分, 并合并含有70S核糖體峰餾分；

【濃縮保存】

將MgCl2濃度升高至10 mM, 并用緩沖液［50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME］將體積補(bǔ)充到1 mL；

4℃下用Type 60 Ti角轉(zhuǎn)頭40000rpm離心13小時(shí)；

將沉淀洗滌并重懸于250μL的緩沖液［50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME］中（通常產(chǎn)生4mg核糖體）；

4℃用微量離心機(jī)中離心2min后, 將核糖體等分, 在干冰/乙醇浴中快速冷凍, 并儲(chǔ)存在 -80℃；

【核糖體解離】

70S核糖體 通過1mM Mg2+低鹽緩沖液透析對(duì)Tris-polymix緩沖液進(jìn)行透析, 解離出30S和50S亞基, 后在同一緩沖液中進(jìn)行蔗糖梯度超速離心。

實(shí)例7  50S、30S核糖體亞基的分離（Ivan B Lomakin, 2023）

【超離純化】

重復(fù)70S核糖體提取流程中提取操作；

【核糖體解離】

收集經(jīng)第二輪蔗糖梯度離心后沉淀, 用解離緩沖液［20mM Tris–HCl/pH 7.4, 60mM NH4Cl, 1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 14mM β-ME)重懸；

加樣在15–40%蔗糖梯度溶液 [20mM HEPES–KOH 、60mM NH4Cl、1mM MgCl2、14mM β-ME、15–40%(w/v) sucrose]頂部, 用SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭28000rpm、4℃離心16小時(shí)；

收集50S和30S亞基對(duì)應(yīng)餾分；

以離心濃縮器過濾操作并重復(fù)兩次。

實(shí)例8 哺乳動(dòng)物細(xì)胞核糖體重構(gòu)（JμLia Flis, 2018）

兔網(wǎng)織紅細(xì)胞制備不含內(nèi)源性tRNA和mRNA的冷凍電鏡樣品。組織培養(yǎng)物(HEK293T)的核糖體亞基純化用于smFRET實(shí)驗(yàn)（JμLia Flis, 2018）

【細(xì)胞裂解】

將300mL經(jīng)核酸酶處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物用50.2Ti轉(zhuǎn)子4℃下40000rpm離心3小時(shí)；

將沉淀洗滌并重懸于緩沖液(5mM HEPES/pH 7.5, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2mM DTT)中；

測定溶液A260值, 計(jì)算核糖體濃度約（20mg/mL)（核糖體濃度-A260測定值轉(zhuǎn)換計(jì)算系數(shù)為：40S亞基為60 pmol/A260, 60S亞基為30 pmol/A260, 80S核糖體為20 pmol/A260）；

【核糖體解離】

將KCl濃度調(diào)節(jié)至0.5M, 加入新鮮制備的嘌呤霉素(Puromycin；1mg/mL), 按100mg核糖體1mg嘌呤霉素比例, 將最終核糖體濃度調(diào)節(jié)至10mg/mL并保持0.5M KCl，冰上孵育30min, 再經(jīng)37℃孵育15min（解離核糖體亞基）；

緩沖液分層到以10 – 30%的線性蔗糖梯度溶液中［5mM HEPES/pH 7.5、500mM KCl、5mM MgCl 2、2mM DTT］, 4℃下18000rpm 的速度用SW 32 Ti水平轉(zhuǎn)頭離心18小時(shí)；

監(jiān)測A260采集各密度梯度餾分；

40S和60S餾分峰混合并用緩沖液1：1稀釋后，用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃下40000rpm離心18小時(shí), 將50mM HEPES/pH 7.4, 30mM MgCl2, 2mM DTT］核糖體沉淀；

將核糖體沉淀重懸于緩沖液［20mM HEPES/pH 7.4, 50mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT］中，經(jīng)液氮冷凍后-80℃儲(chǔ)存。

3.4 Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭用于核糖體分離小結(jié)

      無論原核、真核生物細(xì)胞，核糖體的分離制備過程依稀有章可循。

3.4.1 細(xì)胞裂解-差速離心-核糖體濃縮三步曲

      對(duì)于培養(yǎng)的原核、真核細(xì)胞，在細(xì)胞群處于對(duì)數(shù)生長期（即培養(yǎng)液OD600測定值達(dá)到0.5-1.0 AU/mL）離心收獲菌體。此時(shí)細(xì)胞分裂繁殖旺盛，胞內(nèi)的核酸復(fù)制與蛋白合成處于高產(chǎn)期。從為數(shù)不多的報(bào)道看，視菌屬和培養(yǎng)條件不同，核糖體分離所用的初始培養(yǎng)基體積0.5 - 2L，可收獲到菌體濕重2-12g，最終核糖體產(chǎn)量4-12mg。

      與細(xì)胞碎片、細(xì)胞核、線粒體、微粒體、溶酶體和葉綠體比，核糖體密度較小、沉降系數(shù)小。因此，與細(xì)胞外囊泡分離類似，通過細(xì)胞沉淀-碎片雜質(zhì)沉淀-核糖體沉淀步驟，用階梯式升高的差速離心方法是核糖體制備的基礎(chǔ)手段。

      核糖體制備的超速離心流程包括兩個(gè)基本步驟：一是Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭沉淀，二是SW 32 Ti、SW 28或SW 32.1 Ti水平轉(zhuǎn)頭蔗糖連續(xù)密度梯度純化。

      Type 45 Ti單管容量70-94mL，滿載情況下一次運(yùn)行可離心400-550mL細(xì)胞裂解液，與Type 50.2 Ti（12×39 mL）處理處理效率相當(dāng)而高于Type 70 Ti（8×38.5mL）處理通量。除主要承擔(dān)從澄清后細(xì)胞裂解液或蔗糖溶液離心中將核糖體沉淀，制備核糖體粗提物外，還被用于替代Amicon Ultra (100?kDa NMWL)過濾器，將核糖體經(jīng)蔗糖連續(xù)密度梯度純化的餾分濃縮處理。Type 45 Ti采用40000-45000rpm(對(duì)應(yīng)的RCFav 相當(dāng)于124948-158137×g)的工作轉(zhuǎn)速時(shí), 與分離EVs及可溶性蛋白組分時(shí)轉(zhuǎn)速相當(dāng), 但離心時(shí)間較長（以15-21小時(shí)常見）。 

3.4.2 核糖體亞基分離

      當(dāng)溶液中Mg2+濃度≥10nM核糖體處于緊密耦合狀態(tài)，而降低g2+濃度至2nM時(shí)核糖體發(fā)生解離,利用這一特點(diǎn)，在成功分離完整核糖體后，只需調(diào)整MgCl2濃度，即可實(shí)現(xiàn)在相同技術(shù)流程中選擇性制備完整核糖體或核糖體組成亞基。因此，無論是提取緩沖液 或純化用蔗糖梯度溶液，均采用10mM或更高濃度的MgCl2溶液；而30S、50S亞基分離環(huán)節(jié)中, 緩沖液中MgCl2的濃度常降低至1mM。

      完整核糖體顆粒，如原核細(xì)胞的70S核糖體，比核糖體組成小亞基（如30S、50S）的沉降系數(shù)大，沉降速度快，相同離心時(shí)間內(nèi)氣遷移距離長。在制備核糖體亞基的環(huán)節(jié)中，核糖體解離亞基，如30S、50S聚集形成的密度條帶會(huì)落后于完整核糖體的條帶。同樣道理，為確保實(shí)驗(yàn)效率，在核糖體亞基蔗糖密度梯度離心分離環(huán)節(jié)，可設(shè)定比分離完整核糖體時(shí)高的工資轉(zhuǎn)速，以提高亞基分離效率、提高小亞基組分的回收率。

四、討論

      按文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，在Beckman立式超速離心機(jī)在役轉(zhuǎn)頭中，Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭是僅次于Type 70 Ti角轉(zhuǎn)頭(8×38.5ml)的高頻率使用角轉(zhuǎn)頭。

      蛋白、病毒、細(xì)胞器及納米顆粒物分離，被認(rèn)為是超速離心技術(shù)的經(jīng)典應(yīng)用領(lǐng)域，在上述117例與Type 45 Ti有關(guān)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道中確已有所體現(xiàn)。

      當(dāng)Type 45 Ti以最高轉(zhuǎn)速45000rpm運(yùn)行時(shí)，其RCFav 158000×g的輸出性能，被證明是很好地適應(yīng)了細(xì)胞外囊泡(EVs)、細(xì)胞核糖體及蛋白活性組分分離制備對(duì)離心力的要求。

      Type 45 Ti的單管容量高達(dá)94mL，樣品離心通量居所有現(xiàn)役超速工作轉(zhuǎn)頭之首。這對(duì)于從多達(dá)1-2L體積的細(xì)胞、菌體培養(yǎng)物中提取蛋白、EVs和核糖體，大有裨益。

      在Beckman立式超速離心機(jī)中，Type 70 Ti、Type 45 Ti和Type 50.2 Ti是報(bào)道中最常使用的三個(gè)角轉(zhuǎn)頭。與Type 45 Ti（6×94mL；45000rpm/RCFav 158000×g；k factor 133）相比，Type 50.2 Ti（12×39mL；50000rpm/RCFav 227000×g；k factor 69）的最大工作容量基本一致，而最高工作轉(zhuǎn)速、RCFav和k factor則略勝一籌。因此，就EVs、核糖體和蛋白制備而言，三者間Type 50.2 Ti的綜合效能居首無疑。

      在角轉(zhuǎn)頭工作過程中，各種細(xì)胞器、可溶性蛋白組分和囊泡在強(qiáng)大離心力作用下向外、向下沉降。而密度相對(duì)較低的脂質(zhì)組分則在溶液中向內(nèi)、向上飄浮。這一原理被應(yīng)用于組織細(xì)胞中脂蛋白、游離脂肪酸、脂質(zhì)體等脂質(zhì)組分的分離。

      上述實(shí)例中，關(guān)于脂質(zhì)分離應(yīng)用的報(bào)道數(shù)量微不足道。這一方面意味著Type 45Ti憑借RCFav 158000×g性能可將脂質(zhì)與其它胞內(nèi)活性組分完全分離的支持證據(jù)不足。同時(shí)還應(yīng)看到，與Type 70 Ti（8×38.5mL，φ25×89mm；70000rpm/RCFav 361000×g，k factor 44）和Type 50.2 Ti（12×39mL，φ25×89 mm；50000rpm/RCFav 227000×g；k factor 69）比，一個(gè)顯著區(qū)別在于離心管尺寸不同。Type 45 Ti（6×94mL，φ38×102 mm；45000rpm/RCFav 158000×g；k factor 133）所用的94mL超速離心管管徑、管長均大于Type 70、Type 50.2所用的38.5mL管。脂質(zhì)組分分離后，與PA材質(zhì)管材內(nèi)壁存在較大接觸面，會(huì)造成脂質(zhì)大量吸附，不利于完整收集。反觀Type 70、Type 50.2，平均離心力大，對(duì)脂質(zhì)之外其它可沉降細(xì)胞組分效能更高，且所用超速離心管的管徑小，內(nèi)壁脂質(zhì)可吸附面積小，樣品回收率更高。

      資料表明，無論是蛋白、核糖體或EVs制備，多數(shù)應(yīng)用報(bào)道中，除Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭外，還需根據(jù)沉淀體積選用單管容量相對(duì)較小的SW 32 Ti（6×38.5mL）、SW 28（6×38.5mL）或SW 32.1 Ti（6×17mL）等水平轉(zhuǎn)頭20000 - 32000rpm實(shí)施1-2輪密度梯度純化。特別是核糖體復(fù)合物重構(gòu)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中，在完整核糖體分離基礎(chǔ)上，通過調(diào)整Mg ²⁺濃度將核糖體亞基解離后，在分離核糖體亞基過程中，盡可能去除內(nèi)源性tRNA，mRNA新生肽鏈伴侶分子和肽鏈膜靶向因子等新生鏈復(fù)合物（RNCs），以制備出高品質(zhì)的冷凍電鏡分析樣品。

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