對2013年以來的抑郁癥(Major depressive disorder, MDD)腦類器官研究應(yīng)用有關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研顯示，迄今為止，絕大部分依托MDD患者iPSC衍生的各種腦細(xì)胞體外模型開展的抑郁癥實(shí)驗(yàn)，仍屬于2D單層培養(yǎng)技術(shù)范疇。抑郁癥人腦類器官屬于腦類器官領(lǐng)域一個(gè)年輕分支，特別有影響的公開實(shí)驗(yàn)報(bào)道，還不多見。

       “Depressive patient-derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C” 一文刊發(fā)于2023年11月的EMBO Mol Med。該報(bào)告是根據(jù)自殺重度抑郁癥(sMDD)患者尸檢報(bào)告發(fā)現(xiàn)的GABAB 受體介導(dǎo)的抑制失調(diào)、GABAA受體2表達(dá)下調(diào)，有自殺行為患者大腦前扣帶皮層中 GABA降低的現(xiàn)象，再結(jié)合依托MDD動(dòng)物模型中的GABAA/B 受體缺陷、GABA合成酶GAD67表達(dá)減少而建立的前額葉GABA能網(wǎng)絡(luò)異常導(dǎo)致MDD的病理學(xué)假說后，選擇腦皮質(zhì)中抑制性GABA能中間神經(jīng)元為研究對象，在參考皮質(zhì)谷氨酸能類器官-皮質(zhì)下類器官組裝體構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，而首次提出了腹側(cè)前腦類器官（ventral forebrain organoids)的概念 ^[1] 。

一、GABA能中間神經(jīng)元相關(guān)抑郁癥腦皮質(zhì)類器官衍生方法范例

1.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生

       iPSCs 的所有實(shí)驗(yàn)程序，包括來自供體的血液采樣，均獲南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2016330)。

1.1分離人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) ^[2] 。

       1) 通過靜脈穿刺從供體收集10ml肝素化全血。

       2) 將全血用10mL D-PBS緩沖液稀釋后，獲得20ml稀釋血溶液【注：PBS,即Phosphate-Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液，能夠提供相對穩(wěn)定的離子環(huán)境和 pH 緩沖能力是生物學(xué)中經(jīng)常使用的緩沖鹽溶液。D-PBS緩沖液，Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，即杜氏磷酸鹽緩沖液，與人體 pH 相近，溶液滲透壓與人體血液等滲，不含 Ca2+、Mg2+，是具有短期維持細(xì)胞活性功能的一種平衡鹽溶液。適用于解離前清洗細(xì)胞、運(yùn)輸細(xì)胞或組織、稀釋細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和制備試劑等各種細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用】。

       3) 將15mL Ficoll溶液（Ficoll-Paque PREMIUM)放入新的50ml錐形管中【注：Ficoll-Paque PREMIUM，即用型無菌密度梯度離心介質(zhì)，設(shè)計(jì)用于通過外周血、骨髓和臍帶血制備單核細(xì)胞】。

       4) 用電動(dòng)移液器，將20mL稀釋血液溶液沿著管內(nèi)壁緩慢流動(dòng)的方法，鋪設(shè)至Ficoll溶液上面。注意不要混合血液溶液和Ficoll溶液。

       5) 常溫下400×g離心30分鐘 (Thermo CL2離心機(jī)已由Sorvall ST 8R小型離心機(jī)取代)。將離心減速速度設(shè)置為“慢”。注意：離心后，在上部乳白色血漿層和下部透明Ficoll層之間出現(xiàn)一層白色薄層，其中包含單核細(xì)胞。

       6) 用1ml移液器將單核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的50ml錐形管中。注意不要吸入底部Ficoll溶液。

       7) D-PBS 緩沖液添加到上一步分離的單核細(xì)胞液樣中至總體積為10ml，常溫下200×g離心5分鐘。

       8) 棄上清，向單核細(xì)胞沉淀中加入10mL D-PBS 緩沖液，再次常溫下200×g離心5分鐘。

       9) 棄上清，向收集的單核細(xì)胞中加入1mL KBM502培養(yǎng)基，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。如上述步驟操作得當(dāng)，從10ml全血中可獲得超過5×106個(gè)單核細(xì)胞。

       10) 用D-PBS制備濃度為10μg/ml的抗人CD3抗體溶液。將抗人CD3抗體溶液加入6孔板中，浸泡每個(gè)孔表面，在 37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育至少30分鐘（Thermo Scientific HERAcell 150i CO2 培養(yǎng)箱已由HERAcell 150i取代)。

       11) 從培養(yǎng)板移除抗人CD3 抗體溶液，并用D-PBS緩沖液洗滌一次。

       12) 間收集的單核細(xì)胞溶液以2.5×105個(gè)細(xì)胞/cm2 的密度接種在抗人CD3 抗體包被的6孔板上，用KBM502培養(yǎng)基中，37℃ 5%-CO2 培養(yǎng)箱中孵育3-7天，不更換培養(yǎng)基，直到T細(xì)胞達(dá)到70%的融合度。

【注：Keiichi Fukuda研究團(tuán)隊(duì)2012發(fā)表于Nat Protoc的“Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus”因無法查閱，以上操作流程引自該團(tuán)隊(duì)2015年在J Vis Exp發(fā)表的“Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions”】

1.2 PBMCs重編程誘導(dǎo)為iPSCs

       使用CytoTune-iPS 2.0 仙臺(tái)病毒重編程試劑盒對PBMCs進(jìn)行重編程。

       感染24小時(shí)后，將感染的細(xì)胞以每皿1.25×105個(gè)細(xì)胞的密度轉(zhuǎn)移到含有絲裂霉素C（mitomycin C, MNC)-滅活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞)的六孔板中，并以1：1比例MNC 培養(yǎng)基/hiPSC組成混合培養(yǎng)基一起孵育24小時(shí)。

       感染48小時(shí)后，用 hiPSC 培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基。

       iPS 集落在第 12 天后出現(xiàn)。一旦出現(xiàn)，就替換 Essential 8培養(yǎng)基培養(yǎng)，并傳代到無滋養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)(Life Technology)上。

1.3 iPSC分化為GINs和腹側(cè)前腦類器官

1) iPSCs維持和傳代

       sMDD iPSC和CTRL iPSC系用E8 培養(yǎng)基(Life Technology)維持在Vitronectin‐coated (Life Technology)板上，每天更換一半 Essential 8 培養(yǎng)基。

       培養(yǎng)基直至iPSCs集落達(dá)到70%融合度時(shí)（每隔5天，用Nikon Eclipse TS100倒置相差顯微鏡觀察確認(rèn))，用溫和細(xì)胞解離試劑(Stemcell，1 ml/孔)消化菌落1分鐘，然后將細(xì)胞重新接種到六孔板中。

2) 神經(jīng)細(xì)胞分化

       在神經(jīng)分化過程中，iPSCs集落先在1 U/mL 分散酶（Life Technologies)中孵育2分鐘，然后被分離形成胚胎體（embryonic bodies, EBs)。胚胎體隨后懸浮在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(neural induction medium, NIM)中，持續(xù)7天。

       第7天時(shí)，將胚胎體附著在含有8-10%胎牛血清（FBS)的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（NIM: 500ml?F12?+?5ml?N2?+?5ml NEAA)的六孔板中，持續(xù)8-10小時(shí)，并每隔一天更換一次純NIM。

       第10天，可以觀察到玫瑰花結(jié)（rosette)結(jié)構(gòu)【注：分化的細(xì)胞表達(dá)了神經(jīng)干細(xì)胞特異的標(biāo)志物Sox2（紅色)和Nestin（綠色)，在貼壁培養(yǎng)狀態(tài)下呈現(xiàn)極化的玫瑰花花環(huán)狀排布，稱為玫瑰花環(huán)。這實(shí)際上是神經(jīng)干細(xì)胞形成的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)】。第16天時(shí)，用1mL移液管輕輕分離含玫瑰花結(jié)的集落，并將解離的片段懸浮在含有B27（Life Technologies)的NIM中。在懸浮培養(yǎng)物中，從第 10 天到第 25 天總共添加了 1.0 μM SAG，目的是將干細(xì)胞向GABA前體細(xì)胞分化。第 25 天后，每隔一天更換一次 NIM 培養(yǎng)基。

       第28天時(shí)，用TrypLE（Life Technologies)將神經(jīng)球解離為單細(xì)胞后，孵育6-8分鐘。隨后，單細(xì)胞懸液以30000-50000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在Matrigel (BD Biosciences)和poly-l-ornithine（Sigma)預(yù)包被的蓋玻片上，以進(jìn)一步分化神經(jīng)元【注：細(xì)胞計(jì)數(shù)Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set可由Countess III細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countess細(xì)胞計(jì)數(shù)板 C10228替代】。

1.4 腹側(cè)前腦類器官的生成

       對于腹側(cè)前腦類器官的生成方法描述為：“We generated ventral forebrain organoids by adapting our previously established method (Yuan et al, 2020). In total, 1.0?μM SAG was added from day 10 to day 25 in the suspension culture. After day 25, NIM medium was changed every other day.”【在懸浮培養(yǎng)物中，從第10天到第25天總共添加了1.0 μM SAG。第25天后，每隔一天更換一次 NIM 培養(yǎng)基?！?/span>

而所參考的Yuan等人的論文（2020、2023兩篇文章的通訊作者為同一人)中相關(guān)內(nèi)容為：

       To more systematically test the role of LHX6 in migration, we used fused forebrain organoids to determine the GI migration from ventral to dorsal. Cerebral organoids and ventral MGE organoids were generated from hPSCs by following the reported protocols with slight modification, which mimic the endogenous developmental environment more closely than 2D culture (Birey et al., 2017). To induce region-specific brain organoid, cerebral organoids were generated by default and ventral forebrain organoids were patterned with SAG, respectively. After 60 days culture from hPSCs, the cerebral organoids exhibited multiple cortical layer-like structures, with expressing cortical markers PAX6, TBR1, CTIP2, as well as neural progenitor markers SOX2 and NESTIN. 5 weeks old ventral forebrain organoids expressed NKX2.1, GABA and GAD67.

       在該文“補(bǔ)充材料”中給出了腹側(cè)前腦類器官的生成方法是“Forebrain organoids culture and organoids fusion)”：

       For organoids culturing, embryoid bodies (EBs) were continuously cultured in neural induction medium (NIM) till day35 or longer time. For dorsal organoids patterning, hPSC derived organoids were cultured under spontaneous condition. For ventral organoids patterning, 500nM SAG was added from day 10 to day 25. Ventral organoids were infected with GFP lentivirus. To fuse dorsal and ventral organoids, one single dorsal organoid and one single ventral organoid were placed together in one 1.5ml EP tube at 37°C in a 5% CO2 incubator. After three days, fused organoids were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for further analysis. For each group, n≥5. GFP+ Cells in ventral organoids were divided into two groups by the length from the soma location to the dorsal organoids’ border line(<100 μm and ≥100μm,respectively). Cell numbers in this two groups were counted for quantification. ^[3]

       綜合起來，腹側(cè)前腦類器官生成方法應(yīng)是這樣的：

       為系統(tǒng)測試LHX6在GINs從腹側(cè)到背側(cè)的遷移過程中的作用，采用先分別生成背側(cè)腦類器官（Cerebral organoids)和腹側(cè)MGE類器官（ventral MGE organoids)兩個(gè)腦區(qū)特異性類器官，再經(jīng)二者融合成前腦類器官模型。兩個(gè)腦區(qū)類器官是“是遵循Yuan等人2020年報(bào)告的方案并進(jìn)行了輕微修改后從hPSC生成的，它比2D培養(yǎng)更接近內(nèi)在發(fā)育環(huán)境（Birey等人，2017年)?！?/span>

1.4.1 背側(cè)腦類器官的生成

       胚胎體(EBs)在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NIM)中連續(xù)培養(yǎng)至第35天或更長時(shí)間（在自發(fā)條件下培養(yǎng)，不經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染)。

1.4.2 腹側(cè)MGE類器官的生成

       胚胎體(EBs)現(xiàn)在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NIM)中連續(xù)培養(yǎng),從第10天開始到第25天，每日加入500nM SAG【注：SAG是一種有效的Smo受體激動(dòng)劑，能夠活化Sonic hedgehog信號通路，誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖而不影響新生細(xì)胞的分化模式，在背腹側(cè)神經(jīng)管發(fā)育中很重要】，并（在適當(dāng)時(shí)機(jī))用搭載GFP報(bào)告基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染腹側(cè)MGE類器官。

1.4.3 類器官組裝體的生成

       分別將一個(gè)背側(cè)腦類器官和一個(gè)腹側(cè)MGE類器官放在一個(gè)1.5ml的EP管中，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三天后生成融合型類器官用4% PFA固定，以便進(jìn)一步分析。每組樣本≥5。腹側(cè)MGE類器官的GFP+細(xì)胞根據(jù)從體細(xì)胞位置到背側(cè)類器官邊界線的距離分為兩組（<100μm 和≥100μm )，對兩組細(xì)胞進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)分析。

       類器官培養(yǎng)過程質(zhì)控：從hPSCs培養(yǎng)60天后，背側(cè)腦類器官出現(xiàn)多個(gè)皮質(zhì)層樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)皮質(zhì)標(biāo)志物PAX6、TBR1、CTIP2以及神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物SOX2和NESTIN。而5周齡腹側(cè)MGE類器官表達(dá)NKX2.1、GABA和GAD67。

二、GABA能中間神經(jīng)元相關(guān)抑郁癥腦皮質(zhì)類器官的表征方法

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry)

       將蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞用含4%多聚甲醛(PFA)的PBS中在室溫下固定30分鐘，然后用PBS洗滌10分鐘，共3次。

       將所有細(xì)胞在0.2% Triton X-100中透化10分鐘后，用10%驢血清中封閉處理1小時(shí)。將一抗用含0.1% TritonX-100和5%驢血清的PBS稀釋后，所有蓋玻片與一抗緩沖液在4℃下避光孵育過夜。

       第二天，用PBS沖洗細(xì)胞，并與物種特異性AlexaFluor 488-、AlexaFluor 546-或AlexaFluor 647偶聯(lián)的二抗（1/2000;ThermoFisher)，然后用Hoechst 33258染色以對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

       用Nikon 80i正置顯微鏡或Zeiss LSM-800激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

2.2 熒光圖像的定量分析

2.2.1 GINs的分化率分析

       從sMDD組和對照組的每個(gè)蓋玻片中隨機(jī)選擇至少9個(gè)視野，圖像分析軟件Image J對 GABA 和TUJ1陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)【注：Tuj1抗體被證實(shí)僅識(shí)別神經(jīng)細(xì)胞的Neuronal Class III β-Tubulin，不識(shí)別膠質(zhì)細(xì)胞的β-Tubulin，被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞的免疫染色鑒定。】。

       生成了腹側(cè)前腦類器官在第 30 天表達(dá) GAD67、神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物 SOX2 和腹側(cè)前腦祖細(xì)胞標(biāo)志物 NKX2.1。

2.2.2 單個(gè)GINss形態(tài)Sholl分析

       用Image J軟件Sholl Analysis插件，以GINs的核為起點(diǎn)繪制多個(gè)半徑相差10μm的同心圓。計(jì)算每個(gè)同心圓與GINs分支的交點(diǎn)數(shù)量、最大交點(diǎn)數(shù)和總交點(diǎn)數(shù)。sMDD組與CTRL組之間的統(tǒng)計(jì)差異通過單因素方差分析和嵌套t檢驗(yàn)進(jìn)行分析【注：Sholl分析技術(shù)由倫敦大學(xué)學(xué)院的Donald Sholl在1953年創(chuàng)建，用于定量分析神經(jīng)元軸突和樹突的方法。是將一組同心圓疊加到神經(jīng)元胞體上，通過計(jì)算與每個(gè)圓相交的分支數(shù)，得出對不同區(qū)域的神經(jīng)元樹突和軸突的分支模式，從而定量表征神經(jīng)元形態(tài)特征。】。

2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄分析（Whole-cell patch-clamp recordings)

       將蓋玻片置于含有以下成分的浴液中：145?mM NaCl, 1?mM CaCl2, 5?mM KCl, 1?mM MgCl2, 5?mM HEPES, and 5?mM glucose (280 mosM, pH 7.3)。

       神經(jīng)元通過Olympus BX51WI型正置顯微鏡的60×水浸物鏡觀察。

       Digidata 1550B（Molecular Devices)進(jìn)行數(shù)字化處理，通過Axon MultiClamp 700B differential amplifier (Molecular Devices)采集，并使用Axon Clampex軟件（Molecular Devices)進(jìn)行分析。電阻為6–10 MΩ的記錄電極被填充了含有以下成分的細(xì)胞內(nèi)記錄溶液：130?mM?K‐gluconate, 10?mM KCl, 10?mM EGTA, 2?mM MgCl2, 0.3?mM Na‐GTP, 2?mM Na‐ATP, and 10?mM HEPES (280 mosM, pH 7.3)。全細(xì)胞膜片鉗記錄在6–8周齡的GINs中進(jìn)行。所有記錄均在室溫下進(jìn)行。

       為驗(yàn)證 Trzd 處理后 sMDD GIN 的神經(jīng)元活性，電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) AP 的振幅和誘發(fā)的 AP 數(shù)隨著 Trzd 的處理而降低，以及 AP 的半寬。此外，Trzd 治療導(dǎo)致快速鉀電流和鈉離子向內(nèi)電流與 CTRL 組相當(dāng)。

2.4 鈣離子成像分析

       在第 28 天將 GIN 和腹側(cè)前腦類器官接種在涂有 Matrigel (Corning)的共聚焦培養(yǎng)皿上。鈣成像實(shí)驗(yàn)在接種GINs后2周以內(nèi)，腹前腦類器官附著后2-3天進(jìn)行。

       在 37℃ 下用 1 μM Fluo-4 AM (Life Technologies)加載溶液處理GINs或腹前腦類器官15-30分鐘，隨后在室溫下繼續(xù)處理15-30分鐘，并用 DPBS (Life Technologies)洗滌細(xì)胞。最后，將細(xì)胞置于制備成像的活細(xì)胞成像溶液中。

       用配備20倍物鏡的Zeiss 800共聚焦熒光顯微鏡在 488 nm激發(fā)波長下進(jìn)行單細(xì)胞尺度的鈣成像。

       以 1 幀/3.2 秒的速度捕獲時(shí)間序列圖像。在成像開始后約1分鐘，用高濃度KCL溶液（67 mM)刺激細(xì)胞。用Image J軟件和Prism（v8，GraphPad)分析單細(xì)胞鈣活性。在藥物測試實(shí)驗(yàn)中，GINs先與NIM稀釋的藥物孵育5天，然后用Fluo-4 AM裝載溶液處理，清洗后，在第40天進(jìn)行活細(xì)胞鈣成像。在藥物處理實(shí)驗(yàn)中，GINs用10 μM Trzd處理5天，腹側(cè)前腦類器官則處理7天。

       圖像顯示，sMDD組來源的類器官中鈣離子信號上升幅度顯著低于對照組比類器官的表現(xiàn)。

2.5 干細(xì)胞分化標(biāo)記物實(shí)時(shí)PCR分析——驗(yàn)證sMDD 5-HT2CR mRNA表達(dá)的下調(diào)

       使用Trizol試劑盒（Life Technology Inc)分離RNA樣品，并使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit (Beijing TsingKe將每個(gè)樣品中的1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

       在20μl反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，其中包括2μlcDNA、1μl正向和反向引物、7μl ddH2O和10μl 2X SYBR Green RCR預(yù)混液（Vazyme)。GAPDH為看家基因進(jìn)行歸一化處理（qPCR 的引物序列見表 EV3)。擴(kuò)增條件：變性（98℃ 10s)、退火（56℃ 10s)和延伸（72℃ 10s)，共40個(gè)循環(huán)。

2.6 Western blotting印跡——驗(yàn)證sMDD  5-HT2CR翻譯水平降低

       將 GIN 在含有混合物的 RIPA 緩沖液 (Roche)中在冰上裂解 20 分鐘（獲得 20-30 μg 蛋白質(zhì))，并在含有SDS和 β-巰基乙醇的上樣緩沖液中稀釋。將蛋白質(zhì)在 100℃ 下加熱 8 分鐘以使蛋白質(zhì)變性后，將蛋白質(zhì)加載到 10%分離凝膠中在 100V 電壓持續(xù)70-90 分鐘分離后。以 300 mA-100 分鐘轉(zhuǎn)PVDF膜。4℃下將膜用 5% 牛奶稀釋的一抗中孵育過夜。第二天，倒出初級抗體，并用TBST洗滌膜3次，每次5分鐘。然后將二抗在搖床上室溫孵育 1 小時(shí)。孵育完成后，用 TBST 重洗膜 5 分鐘 3 次。將魯米諾底物溶液A和B按1：1的比例混合，并在暗室中加入到膜表面。采用 ECL 系統(tǒng)檢測蛋白條帶，即可獲得蛋白質(zhì)的表達(dá)量。 

2.7 轉(zhuǎn)錄組分析(Bulk RNA sequencing analysis)

       2.7.1 用 Trizol 試劑盒 (Life Technology Inc)提取總 RNA，并通過 Oligo (dT)珠子富集 mRNA，然后轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

       2.7.2 Illumina HiSeq 2500平臺(tái)完成文庫構(gòu)建和RNA測序。

2.7.3 數(shù)據(jù)分析：

       RNA-seq讀段使用HISAT2（v.2.1.0)與人類參考基因組GRCh38和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對。

       用DESeq2包（v.1.30.0)進(jìn)行RNA差異表達(dá)分析，設(shè)定的截止標(biāo)準(zhǔn)為調(diào)整后的P值< 0.05，且絕對log2折疊變化≥1；

       用EnhancedVolcano包（v.1.10.0)生成的火山圖展示上調(diào)或下調(diào)的基因數(shù)量；

       在Reactome在線平臺(tái)上進(jìn)行Reactome通路分析；

       用clusterProfiler包（v.4.0.2)進(jìn)行基因本體（GO)分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG)通路分析；

       通過pheatmap包（v.1.0.12)生成的熱圖展示基因的表達(dá)情況；

       基于DrugBank數(shù)據(jù)庫，在NetworkAnalyst網(wǎng)絡(luò)可視化分析平臺(tái)上分析藥物與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間的相互作用。

對 CTRL 和 sMDD 樣品進(jìn)行了差異表達(dá)分析：

       在 sMDD 組中差異表達(dá)的基因與MDD的相關(guān)性最大，顯示細(xì)胞模型概括了抑郁癥和精神分裂癥的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。

       GSEA分析顯示，GABA能神經(jīng)元分化和鉀通道活性相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)，而高壓門控鈣通道活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，表明 sMDD GIN 中的鈣通道功能的變化。

       對所有 GIN 細(xì)胞重復(fù)聚類程序顯示，eIN 和 mIN 細(xì)胞類型中子簇的UMAP可視化顯示了六個(gè) GIN 簇，CTRL和sMDD 樣本中子簇的相對比例。sMDD神經(jīng)元所反映突觸成熟和可塑性的基因表達(dá)以及SYT1、SYT4、SYT11、SYP、GAP43對鈣的反應(yīng)下調(diào)，與之前觀察到的 sMDD 組 GIN 功能受損一致。

       用 CellChat比較CTRL 和 sMDD 兩組樣本中不同 GIN 子集群之間相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度后顯示，sMDD 組中的 GIN 在幾乎所有類型的配體-受體相互作用中都顯示出相互作用次數(shù)減少和連接水平降低，尤其是在與 ECM 受體相關(guān)的相互作用中，這表明 sMDD GIN 感知和響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)（如鈣、生長因子和生物活性分子)的能力受損。

【注：考慮到為單細(xì)胞測序而制備單細(xì)胞懸液的熱酶解過程，可能會(huì)誘導(dǎo)即刻早期基因（Immediate-Early Response Genes，IEGs，如Fos、Jun或其他激活蛋白相關(guān)基因)、轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白（Heat-shock Proteins，HSPs)等基因激活干擾基因表達(dá)差異分析結(jié)果。為明確單細(xì)胞測序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以分析單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和 Bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)的表達(dá)相關(guān)性，評估組織單細(xì)胞數(shù)據(jù)是否受組織解離影響。若基因在兩組測序結(jié)果中表達(dá)量接近，并且單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和 Bulk 測序數(shù)據(jù)整體相關(guān)性高，則表明單細(xì)胞測序整體上沒有明顯受到前期樣本酶解的干擾。】

       為確認(rèn)單細(xì)胞分析結(jié)果的準(zhǔn)確性并更好地檢測編碼低豐度受體的基因的表達(dá)，本文對照組和輕度抑郁癥（sMDD)組在分化5周后進(jìn)行了bulk-seq 分析。

       用DESeq2軟件包確定兩組間發(fā)現(xiàn)了244個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs)，其中65個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，179個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。

       GO富集分析顯示BMP信號通路在sMDD樣本中上調(diào)。

       Reactome通路分析提示，IL-4和IL-13信號通路在sMDD中也增強(qiáng)。

       KEGG通路分析顯示，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用和鈣信號通路在內(nèi)的通路減少，與單細(xì)胞RNA測序結(jié)果一致。

       結(jié)合DrugBank中的DEGs及其靶藥物，構(gòu)建基因-藥物網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)它們與藥物誘導(dǎo)表達(dá)的接近程度對潛在藥物靶點(diǎn)進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)，HTR2C是DEGs中最富集的基因。

 【注：bulk RNA測序分析，即通常說的RNA-seq，轉(zhuǎn)錄組測序分析，廣泛應(yīng)用于全轉(zhuǎn)錄組水平分析差異基因表達(dá)和mRNA差異剪接、RNA翻譯（translatome)和RNA結(jié)構(gòu)組（structurome結(jié)構(gòu)組學(xué))和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（spatialomics)等研究?！?/span>

2.8 單細(xì)胞RNA測序（Single-cell RNA sequencing analysis, scRNA-seq)

2.8.1 單細(xì)胞制備

       通過1ml trypLE (Life Technology)在37℃和5%二氧化碳的條件下處理30分鐘，將體外分化35天的粘附性GABA能神經(jīng)元解離成單個(gè)細(xì)胞。低速離心去除細(xì)胞碎片和其他聚集物；

2.8.2 文庫制備

       文庫制備：每個(gè)樣本大約有5000個(gè)細(xì)胞被捕獲到Chromium single cell 3′芯片(10X Genomics，PN-120236)上，每個(gè)細(xì)胞釋放的RNA通過在乳化物中的單個(gè)凝膠珠中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并條形碼化；

       用Bio Rad的S1000 Touch Thermal Cycler在53℃下進(jìn)行45分鐘的逆轉(zhuǎn)錄，接著在85℃下處理5分鐘后，4℃保溫；

       cDNA的質(zhì)量用Agilent 4200（Agilent Technologies)評估；

       scRNA-seq文庫用Chromium single cell 3′Library & Gel Bead Kit V3建立。

2.8.3 mRNA測序

       在Illumina NovaSeq6000上以每個(gè)細(xì)胞至少750000個(gè)讀取的測序深度進(jìn)行測序。

2.8.4 數(shù)據(jù)分析、可視化和解讀

       原始測序數(shù)據(jù)用Cell Ranger軟件3.1版（10X Genomics)處理，生成FASTQ文件，并使用GRCh38人類參考基因組進(jìn)行比對。用Cell Ranger結(jié)果中的基因表達(dá)矩陣，通過R 4.1.1進(jìn)行后續(xù)分析；

       通過Sctransform方法進(jìn)行歸一化處理，以去除每個(gè)Seurat對象線粒體映射百分比的變異；

       數(shù)據(jù)集的整合也通過Seurat中的整合函數(shù)來校正批次效應(yīng)。用PCA進(jìn)行降維，前40個(gè)主成分用于生成聚類，采用K-means算法和基于圖的算法；

       UMAP圖展示了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜型的可視化，使用Louvian模塊優(yōu)化算法對相似細(xì)胞進(jìn)行聚類。利用已知的細(xì)胞標(biāo)記基因來注釋不同的生物細(xì)胞類型。Seurat中的FindMarkers功能在默認(rèn)參數(shù)下用于識(shí)別不同樣本間的DEGs。通過PsyGeNET數(shù)據(jù)庫評估已識(shí)別的DEGs與已知精神疾病之間的關(guān)聯(lián)。用fgsea（v.1.18.0)進(jìn)行GSEA分析；

       VoxHunt（v.1.0.0)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的無偏空間映射；

       CellChat（v.1.1.3)顯示不同GABA能神經(jīng)元亞群內(nèi)和之間的所有已知配對的配體和受體，評估潛在的細(xì)胞間通信。

       單細(xì)胞測序可對同一類型細(xì)胞的不同功能狀態(tài)、細(xì)胞構(gòu)成進(jìn)行分析，并能夠消除Bulk測序中細(xì)胞異質(zhì)性問題。

       為了檢測轉(zhuǎn)錄組譜型的變化，對NC3-1和SA005-1細(xì)胞系進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序。提取所有GINs細(xì)胞，單細(xì)胞RNA測序每個(gè)樣品中有3000多個(gè)細(xì)胞，采用與GINs發(fā)育相關(guān)的每個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子定義亞簇。UMAP分析根據(jù)已知細(xì)胞類型標(biāo)志物的表達(dá)確定了五種主要細(xì)胞類型，包括周期細(xì)胞［注：周期細(xì)胞，即cycling cells, CyC。CyC亞群細(xì)胞高表達(dá)一些與細(xì)胞周期相關(guān)基，而被單獨(dú)聚成一群，其中包含多種細(xì)胞亞群］、神經(jīng)元干細(xì)胞（neuronal stem cells, NSC)、腹側(cè)神經(jīng)元祖細(xì)胞（ventral neuronal progenitor cells, vNPC)、早期中間神經(jīng)元（early interneurons, eIN)和成熟的中間神經(jīng)元（mature interneurons, mIN)。由此而確認(rèn)體外生成的細(xì)胞主要是源自MGE的基因異質(zhì)性神經(jīng)元及其前體細(xì)胞。

       將 scRNA-seq 轉(zhuǎn)錄組映射到 Allen Brain Atlas 上顯示，GINs與E13.5小鼠大腦的腹側(cè)前腦相似。與 BrainSpan 數(shù)據(jù)庫的比較顯示與神經(jīng)節(jié)隆起區(qū)域的相關(guān)性最高。故確認(rèn)體外產(chǎn)生的細(xì)胞主要是MG來源GINs及其祖細(xì)胞。

       對sMDD GINs的轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)配體-受體相互作用減少，提示HTR2C表達(dá)缺陷。

參考文獻(xiàn)：

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