（前續(xù)：Optima MAX-XP臺式超速離心機是如何成為細胞外囊泡分離神器的？）

       外泌體（small Extracellular Vesicles/sEVs；習用名exosome/EXO）是由細胞內(nèi)多泡內(nèi)體(multivesicular endosome, MVE)與細胞膜融合后通過胞吐作用釋放到細胞外、直徑30 - 150nm的小型囊泡。外泌體、微囊泡（medium EVs /mEVs；習用名microvesicle, MV）和凋亡小體（large EVs / lEVs; 習用名apoptotic body/AB）共同組成細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）群。外泌體可由造血細胞、B細胞、T細胞、樹突細胞、神經(jīng)元、和腸上皮細胞等所有類型的真核細胞釋放，遍布于血漿/血清、羊水、腹水、乳汁、尿液、關節(jié)腔積液、腦脊髓液及細胞培養(yǎng)基等各種生物體液中。

       外泌體攜帶源自其親本細胞的膜質(zhì)和細胞質(zhì)成份。磷脂雙層膜中嵌入了源自親代細胞的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。四跨膜蛋白CD9、CD63 和CD81及腫瘤易感基因101 蛋白(TSG101)被視為外泌體管家標記。囊泡內(nèi)包含如β-連環(huán)蛋白ADP-核糖基化因子(ARF) 1、表皮生長因子受體(EGFR)、粘蛋白1 (MUC1)、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)、mRNA、microRNA（miRNA）、長非編碼RNA（lncRNA）、及脂質(zhì)相關蛋白和磷脂酶等多種參與信號轉(zhuǎn)導的分子。外泌體囊泡膜上的表面受體能被局部或遠程的受體細胞靶向并捕獲。外泌體與受體細胞結合后，可通過吞噬作用或與細胞膜直接融合的方式釋放囊泡內(nèi)容物，完成細胞間調(diào)控信息的傳遞。
1、多種外泌體分離方法中超速離心技術的地位

       對外泌體表面受體、內(nèi)容物和與細胞功能的研究，首先要分離出足夠數(shù)量和純度的外泌體成分。外泌體囊泡作為納米尺度的微粒，無法通過常規(guī)濾膜過濾方法截留。胞外囊泡體型遠小于細胞（10-30 μm），而不同亞型的細胞外囊泡在離心場中具有不同的沉降速度。通過差速離心，就可將外泌體與樣品溶液中的蛋白質(zhì)、微囊泡、凋亡小體、細胞及細胞碎片分離。國際細胞外囊泡協(xié)會（International Society for Extracellular Vesicles, ISEVs）2016年10月份發(fā)布的用于細胞外囊泡隔離和表征的技術的首次全球調(diào)查報告顯示，超速離心是最常用的外泌體分離方法（但不支持“金標準”的提法）。                                              

2、Optima MAX-XP臺式超離在外泌體分離中的主要應用類型

       截至自2023年8月底，從Pubmed期刊數(shù)據(jù)庫中共采集到Optima MAX-XP臺式超速離心機用于胞外囊泡分離實驗、所發(fā)期刊2023年影響因子iFoid≥6.0的文章63篇。

       依所用外泌體分離起始樣品來源類型和流程差異，可梳理出至少以下9種代表性應用類型。

2.1 細胞培養(yǎng)基外泌體分離

2.1.1 培養(yǎng)細胞外泌體分離

先將收集到的190mL細胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基2500×g離心30分鐘，除去細胞碎片和凋亡小體；

上清20000×g離心60分鐘，分別收集沉淀所得的微囊泡組分、上清；

上清用容量12×39mL的Type Ti 50.2超速離心轉(zhuǎn)頭4℃下110000×g離心2小時，沉淀小囊泡；

收集的小囊泡經(jīng)500μL PBS洗滌，用12×1.5mL容量的Optima MAX-XP超速離心機TLA-55角轉(zhuǎn)頭100000×g和4℃下離心2小時；

然后將MV、外泌體沉淀重懸于50μL DPBS緩沖液中和將未使用并經(jīng)超離排空自帶外泌體處理的對照培養(yǎng)基儲存在80℃用于后續(xù)分析。

2.1.2 培養(yǎng)細胞外泌體分離和蔗糖密度梯度純化

完整收集在無血清調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，在4℃下2000×g離心20分鐘除去細胞碎片，收集上清；

上清用Optima L-80XP超速離心機6×94mL Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下100000×g離心1.5小時；

沉淀經(jīng)PBS洗滌，用Optima MAX-XP超速離心機MLA 80轉(zhuǎn)頭100000×g在4℃離心1h；

收集沉淀后重懸于100μL PBS中；

將100μL外泌體樣品與1mL 60%蔗糖溶液混合后鋪墊于超速離心管底部，再將1mL 30%蔗糖溶液和1mL PBS依次上樣到樣品頂部。在Optima L-80超速離心機SW 55 Ti水平轉(zhuǎn)頭中4℃下150000×g離心16小時；

收集每種餾分各1mL 并與6mL PBS混合以稀釋溶液中的蔗糖；

用Optima MAX-XP超速離心機MLA-80轉(zhuǎn)頭150000×g離心1.5h，除去含蔗糖的上清，收集沉淀；

將沉淀重懸于100μL PBS中儲存以備后續(xù)檢測。

2.1.3 培養(yǎng)細胞外泌體分離和熒光標記

完整收集細胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，經(jīng)1000×g離心10分鐘和2500×g離心25分鐘除去細胞碎片和凋亡小體；

用6×250mL角轉(zhuǎn)頭將上清20000×g離心60分鐘，富集MV組分，同時回收上清；

用Optima-LE 80K超速離心機Type 50.2 Ti轉(zhuǎn)頭將上清110000×g離心2小時沉淀外泌體；

將沉淀重懸于DPBS中-80℃并儲；

制備未與細胞接觸排空EVs的細胞培養(yǎng)基作空白對照；

將與親脂性熒光示蹤染料與外泌體孵育后的待測樣品，用Optima MAX-XP超速離心機TLA-55轉(zhuǎn)頭110000×g離心1小時，除去未與EVs結合熒光染料；

用與EVs相同的超速離心方案進行稀釋染料制備作為陰性對照。

2.1.4 培養(yǎng)細胞外泌體和結構與質(zhì)譜分析

收集大鼠主動脈內(nèi)皮細胞（EC）、血管平滑肌細胞（VSMCs）培養(yǎng)基，300×g離心10分鐘；

2000×g離心20分鐘以除去細胞碎片；

用Optima MAX-XP超速離心機MLS 50水平轉(zhuǎn)頭12000×g離心40分鐘，沉淀去除大囊泡和凋亡小體，收集上清；

上清1100000×g超速離心70分鐘，并分為兩組；

收集的一組沉淀經(jīng)PBS洗滌重懸后用0.2μm濾器過濾， 110000×g離心70分鐘，用于透射電子顯微鏡或質(zhì)譜分析；

另一組沉淀經(jīng)PBS洗滌后，經(jīng)2輪70分鐘110000×g超離富集外泌體顆粒，重懸于 50–100μL PBS 中用于功能研究。

2.2 尿液外泌體分離

將50mL健康男性的尿液4℃下180x g離心10分鐘以除去細胞；

再經(jīng)1560×g、4℃離心20 分鐘沉淀鹽類結晶，收集上清，分成1mL等分-80℃儲存；

將12個1mL尿液等分試樣37℃孵育解凍后合并，1560×g、4℃離心10分鐘除去析出鹽類晶體；

上清用Optima MAX-XP超速離心機TLA-55轉(zhuǎn)頭154000×g，4℃下60分鐘，沉淀外泌體；

沉淀經(jīng)PBS洗滌重懸后，分成四等分儲存?zhèn)溆谩?/span>

2.3 腦脊液外泌體分離

將4mL腦脊液加入含有8μL RNase抑制劑的13×51 mm PA超速離心管中，用PBS調(diào)節(jié)至5 mL；

用Optima Max-XP 臺式超速離心機MLS-50 水平轉(zhuǎn)頭在8℃下120000×g離心80分鐘，減速設置為7；

將細胞外囊泡沉淀與8μL RNase抑制劑在42μL PBS中孵育用于提取RNA。

2.4 羊水外泌體分離

收集羊水去除細胞碎片，4℃下20000×g離心30分鐘，收集細胞外囊泡(EVs)沉淀，并保留上清；

將EVs沉淀重懸于15μL PBS中；

上清轉(zhuǎn)移到11×34mm離心管中，用Optima MAX-XP超速離心機MLA-130轉(zhuǎn)頭4℃下100000×g離心2小時，棄上清；

將沉淀重懸于1mL PBS，再次經(jīng)超速離心，收集沉淀；

將兩次富集的胞外囊泡沉淀合并后，重懸于PBS中，-80℃儲存。

2.5 血液外泌體分離、表征和功能研究

2.5.1 血漿外泌體分離

將血漿分為兩組：一組1mL 用于表征實驗，另一組共4mL用于功能實驗。每組等分樣品用PBS稀釋至7-8mL；

稀釋后血漿轉(zhuǎn)移至PC材質(zhì)超離管（355630），用Optima MAX-XP超速離心機MLA-55角轉(zhuǎn)頭4℃下100000×g離心70分鐘，沉淀sEVs；

棄上清，將sEVs于PBS（7-8mL）中洗滌后重懸，再次超離處理；

將sEVs的沉淀PBS重懸至最終體積100-200μL，-80℃下保存。

2.5.2 血清外泌體分離與質(zhì)譜鑒定

6-8周齡SD大鼠經(jīng)安樂死后左心室心臟穿刺收集血液并轉(zhuǎn)移至15mL Falcon管靜置60分鐘；

10000rpm離心10分鐘沉淀凝塊，收集上清；

上清10000rpm離心10分鐘，棄沉淀收集上清；

用等體積的PBS稀釋上清并以12000×g離心以除去其中的細胞碎片；

以110000×g超速離心120分鐘，沉淀EVs；

將EVs沉淀洗滌，重懸于PBS中

再通過四輪PBS反復洗滌-超速離心后，重懸于尿素裂解緩沖液中用于質(zhì)譜分析。

2.6 牛奶外泌體分離

從山羊和奶牛養(yǎng)殖場收集新鮮山羊奶和牛奶樣品；

將牛奶和山羊奶在4℃下3000×g離心30分鐘以除去細胞碎片，細胞和脂肪，收集上清；

上清4℃下50000×g超速離心1小時，并用0.22μm過濾器過濾獲乳清；

用Optima MAX-XP超速離心機MLA-150角轉(zhuǎn)頭4℃下110000×g離心70分鐘，收集沉淀；

將沉淀重懸于1X PBS，重復一次超速離心；

將最終的沉淀懸浮在1×PBS中并通過0.22μm過濾器過濾后，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/span>

2.7 腹水外泌體(ADE)的分離

先將采集的腹水300×g下離心10min，同時收集上清、細胞沉淀-80℃保存（用于后續(xù)細胞成分的免疫組織化學分析）；

將上清2000×g離心20分鐘，并0.22 μm過濾器過濾；

用Optima MAX-XP離心機100000×g離心70分鐘，將外泌體收集沉淀并溶解在PBS中，-80℃下儲存。

2.8 真菌外泌體分離和碘沙醇密度梯度純化

真菌細胞壁消化液過濾后，將12 mL樣品加入14×89 mm超透明離心管；

用Optima XPN-100 超速離心機SW 41 Ti 轉(zhuǎn)頭4℃、10000×g離心 30分鐘，去除菌體碎片；

用移液管將大部分上清(11.5 mL)轉(zhuǎn)移到一支新離心管中，用新鮮0.7 M NaCl將體積補充至12 mL，4℃下60000×g離心90分鐘；

用移液管除去11.5mL上清，將剩余的0.5mL沉淀重懸；

EVs重懸液轉(zhuǎn)移到13×51 mm PC材質(zhì)超速離心管中，用無菌 20 mM Tris-HCl pH 7.5補充至3 mL，用Optima Max-XP 超速離心機TLA100.3 轉(zhuǎn)頭4℃ 下40000×g離心60分鐘；

棄上清留沉淀，并除去管上部3/4殘留液體；

碘沙醇（Optiprep）不連續(xù)密度梯度液由40%，20%，10%和5%（v / v）四層組成。 將EVs顆粒重懸于1mL 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)中，并與2 mL 60% Optiprep混合以形成40%濃度層。其余密度層通過在 20 mM Tris-HCl pH 7.5 中稀釋60% OptiPrep 儲備溶液配制。依次將每層密度溶液3 mL加入14×89 mm超清離心管中形成梯度，從40%溶液開始，以5%溶液結束。樣品管置于Optima XPN-100 超速離心機SW 41 Ti 轉(zhuǎn)頭中4℃ 下100000×g離心17小時；

去除頂部3mL溶液，收集余下六個餾分，每個餾分1 mL，轉(zhuǎn)移至13×51 mm PC材質(zhì)超速離心管中，用冰冷無菌 20 mM Tris-HCl將樣品體積補充至3.5 mL；

在Optima Max-XP 超速離心機TLA100.3 轉(zhuǎn)頭中4℃ 下40000×g離心；去上清，將沉淀重懸于20 mM Tris-HCl中備用。

2.9 組織細胞外EVs分離

2.9.1 腫瘤組織中分離EVs

從口腔囊狀細胞癌患者的腫瘤組織在清除殘留血液后，將腫瘤組織切成碎片，并用添加膠原酶IV和DNase I的RPMI-1640培養(yǎng)基進行處理后，在37℃下振蕩孵育1小時，將腫瘤組織細胞從細胞外基質(zhì)中解離；

500×g離心10分鐘，除去解離的組織碎片和單細胞沉淀，采集上清；

將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，4℃下用2000×g RCF 10分鐘、10000×g RCF 45分鐘兩輪離心，去沉淀留上清；

上清用Optima MAX-XP離心機MLA-130角轉(zhuǎn)頭4℃下120000×g離心70分鐘，去上清；

收集沉淀并重新懸浮在PBS中保存。

2.9.2 腦組織外泌體分離和純化

生物材料：12個月大的C57BL/6J雄性小鼠的右半腦或人的冷凍腦組織200-300mg。

將腦樣品從-80℃冰箱移至干冰，從干冰直接移至培養(yǎng)皿。用單刃剃須刀片粗切成1-5mm的腦碎片，用移液器將粗切組織轉(zhuǎn)移到含木瓜蛋白酶溶液的15mL錐形管中37℃消化15分鐘；

4℃下300×g離心10分鐘，收集上清；

上清用40μm網(wǎng)格過濾去除除細胞、碎片和未消化組織后，收集濾液；

濾液在2000×g下離心10分鐘，去沉淀回收上清；

將上清轉(zhuǎn)移到70mL PC超速離心瓶，加入冰冷PBS使總體積達到50mL；

用 Type 45Ti角轉(zhuǎn)子4℃下10000×g 離心30分鐘（11000rpm，k因子：2218），收集上清；

上清移液到另一個70mL PC超速離心瓶，4℃下100000×g離心70分鐘，去上清；

將沉淀重懸于4℃ 50 mL PBS中洗滌；

再次4℃ 100000×g離心70分鐘，去上清。

低分辨率蔗糖密度梯度純化步驟：（略）

高分辨率碘沙醇密度梯度純化步驟：

將EVs沉淀重懸于1.5mL冰冷40%（V/V）碘沙醇溶液中，將該溶液鋪墊于14mL薄壁超透明管底部；

依次將1.5m不同濃度的碘沙醇溶液（先 20%，然后 15%，13%，11%，9%，7%）分層鋪墊在EVs重懸液之上；最后將2 mL 5% 碘沙醇溶液作梯度液的頂部（14mL管從上到下，液體分層依次是2mL-5%，1.5mL -7%，1.5mL - 9%，1.5mL -11%，1.5mL -13%，1.5mL -15%，1.5mL -20%碘沙醇梯度液，1.5mL -EVs碘沙醇重懸溶液）

用Optima XE-90立式超速離心機水平轉(zhuǎn)子SW 40 Ti（40000rpm，k因子值137）在 4℃下200000×g 離心過夜 16小時，低制動設置；

收集 1.25 mL頂部餾分1梯度液，轉(zhuǎn)移至4 mL冰冷PBS 的6.5 mL厚壁PC管中；

收集餾分2 – 8各1.5 mL轉(zhuǎn)移至 4 mL冰冷PBS的 6.5 mL厚壁PC管中；

稱量餾分1-7離心管，用PBS填充至11.00±0.02g；

將餾分8分成兩個管，用PBS填充填充至11.00±0.02g；

用MLA80轉(zhuǎn)子(46000rpm,k因子57）或用70.1Ti型轉(zhuǎn)子（40000 rpm，k因子94）在 4℃下100000×g 離心70分鐘；

將各EVs密度餾分分別重懸于30μL冰冷PBS或30 μL AAB 中，以備后續(xù)BCA、蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學、脂質(zhì)組學和RNA分析。

3、小結

       使用Optima MAX-XP臺式超速離心機進行的外泌體分離實驗中，最常用的起始樣品材料是CM培養(yǎng)基培養(yǎng)的各種哺乳動物組織細胞，其次是外周血/血清、動物來源的實體組織（腫瘤組織、腦組織、肌肉等）、尿液、腦脊液、腹水、羊水和牛奶。酵母菌等非哺乳動物來源樣品也見諸報道。

       從分離流程看，大部分實例參考的是《從細胞培養(yǎng)上清液和生物體液中分離和表征外泌體》文中的UNIT 3.22一節(jié)的“Basic Protocol 1：Purification Of Exosomes By Differential Ultracentrifugation”部分（以下簡稱“基礎流程1”）流程中描述的300×g——20000×g——10000×g——100000×g——100000×g五步差速-超速離心分離方法或一過濾二超離的替代方法。收集EVs沉淀直接用于電鏡、Western Blot蛋白和核酸實時熒光定量PCR檢測分析。

       考慮到目前所用基礎操作流程所得到的外泌體組分來源（除了胞質(zhì)MVE來源的外泌體，還有亞細胞區(qū)室，如線粒體等來源的外泌體）、大小和功能的異質(zhì)性，部分實例在兩輪超速離心外增加一次蔗糖或碘沙醇密度梯度離心，將含外泌體粗提物沉淀（實質(zhì)是密度不同小囊泡群）進一步分離，收集不同浮力密度區(qū)帶的餾分，經(jīng)第4次超離沉淀各密度餾分中外泌體顆粒的方法除去蔗糖上清，再收集外泌體用于各項表征分析。

       然而蔗糖用作密度介質(zhì)時有其固有缺點。首先是蔗糖溶液的滲透壓高，除了0.25-0.3M 濃度范圍蔗糖溶液滲透壓（250-300 mOsm/L）與細胞內(nèi)外液體基本等滲外，其他密度梯度層都是高滲壓溶液。蔗糖梯度液高滲會造成細胞器、囊泡等微粒脫水而變形甚至失活。其次，摩爾濃度相似的蔗糖溶液分層后容易發(fā)生擴散混合，阻礙了蔗糖高分辨率梯度生成。因此，蔗糖在分離EVs亞群方面僅部分有效。

       新型非離子惰性碘化復合物碘沙醇（iodixanol，Optiprep是Axis-Shield公司的注冊商品名）溶液粘度低，并可在很寬濃度范圍內(nèi)配制成與細胞等滲的梯度溶液，不影響細胞的形態(tài)和活性。并且碘沙醇溶液粘度相對較低，可形成比蔗糖更窄的密度梯度，使得梯度介質(zhì)具有很高的樣品組分密度分辨率。實驗表明，碘沙醇高分辨率密度梯度液所獲得的總EVs產(chǎn)量與蔗梯度液接近，可區(qū)分胞質(zhì)來源的外泌體和線粒體衍生外泌體（mitochondria-derived mitovesicles）。用碘沙醇取代蔗糖作為密度梯度介質(zhì)純化所得的外泌體，功能活性和形態(tài)結構保持完好，特別適合功能和電鏡分析。 

(后續(xù)：Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離流程中轉(zhuǎn)頭的運用)