百家論壇更多分類
操作規(guī)程
多區(qū)肝臟類器官實(shí)驗(yàn)報(bào)告信息與歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)的對照分析
肝臟是人體最大的消化腺和重要代謝調(diào)控中心，不僅肝臟合成并分泌膽汁酸幫助消耗食物，還參與蛋白質(zhì)、脂類和糖元等物質(zhì)的合成和分解，作為解毒中心，還參與激素、藥物和乙醇等的轉(zhuǎn)化和解毒。在此過程中，肝臟也容易因病毒感染、過量飲酒、炎癥、代謝性因素、遺傳變異以及惡性腫瘤等多種原因引起的損傷，導(dǎo)致肝臟功能逐漸下降并最終發(fā)展為終末期肝病。而治愈終末期肝病唯一方法是進(jìn)行器官移植。遺憾的是，可移植供體肝臟的需求遠(yuǎn)超供應(yīng)，不僅導(dǎo)致約20%患者因缺少肝臟來源而死亡，在等待供體器官的過程給患者帶來了巨大的心理負(fù)擔(dān)的同時(shí)，還可能對患者的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，人類自體肝臟類器官人工生成品是供體肝臟替代方案非常有前途的解決途徑。
2025年4月16日， Nature 刊發(fā)了題為《用人多能干細(xì)胞生成的多區(qū)肝臟類器官》(Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells)的研究報(bào)告（以下統(tǒng)一簡稱為“多區(qū)肝臟類器官”），宣告肝臟類器官實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了里程碑式跨越——具有類似于人體肝細(xì)胞代謝區(qū)域化特征的多區(qū)人肝類器官的誕生。文章出自美國辛辛那提兒童醫(yī)院Takanori Takebe領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，最早于2024年8月30日以“Self-Assembled Generation of Multi-zonal Liver Organoids from Human Pluripotent Stem Cells”題名在bioRxiv在線發(fā)表。有趣的是，此文的通訊作者Takebe，正是《Nature》2013年一篇Research Letter《Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》、2014年7月 Nature Protocols Article《Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》的第一作者。
2024年開發(fā)的多區(qū)人肝類器官[1]與2013年構(gòu)建人肝臟類器官[2-3]比，在關(guān)鍵技術(shù)上的迭代3點(diǎn)。首先，鑒于人類和其他靈長類動物細(xì)胞的L-抗壞血酸合成酶基因，L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶（L-gulono-γ-lactone oxidase, GLO），發(fā)生了嚴(yán)重突變，缺少了嚙齒動物基因序列中存在的多個(gè)外顯子而成為一個(gè)假基因(pseudogene)，導(dǎo)致體內(nèi)自行合成L-抗壞血酸（維生素C）。故用AAV載體將搭載了小鼠 Gulo (mGulo)基因的四環(huán)素(TET)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)敲入人hiPSC細(xì)胞，以激活門靜脈周圍肝細(xì)胞的身份。第二，先分別構(gòu)建門管區(qū)肝類器官和中央靜脈周圍肝類器官后，再將兩個(gè)類器官共培養(yǎng)，經(jīng)自我組裝和融合，衍生了具有三分區(qū)的類器官組裝體。第三，也是最根本突破，在于類器官組裝體具備了人體肝臟那樣沿門管區(qū)-中央靜脈軸細(xì)胞代謝功能分區(qū)的特征。
我們簡單回顧一下肝類器官技術(shù)的歷程，就很容易理解多區(qū)人肝類器官技術(shù)的進(jìn)步價(jià)值。
一、多區(qū)肝類器官組裝體之前的肝臟類器官技術(shù)研究進(jìn)展
肝臟由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（parenchymal cells）和肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞 （Liver non-parenchymal cells, NPC）組成。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，即肝細(xì)胞(Hepatocyte)執(zhí)行，構(gòu)成肝臟質(zhì)量的 80% 和細(xì)胞組成的 60%是肝代謝功能的主要承擔(dān)者。肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞起支持肝細(xì)胞功能的作用，有多種細(xì)胞類型，包括肝內(nèi)皮細(xì)胞（liver endothelial cells, LEC）、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)、膽汁上皮細(xì)胞或膽管細(xì)胞(biliary epithelial cells or cholangiocytes)、庫普弗細(xì)胞(Kupffer cells)和其他免疫細(xì)胞群。
人體肝實(shí)質(zhì)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在空間上排列成六邊形的肝小葉（liver lobules），是肝臟結(jié)構(gòu)和功能的基本組成單元。肝動脈的分支——小葉間動脈血富含O2、激素（如胰島素和胰高血糖素）及代謝產(chǎn)物。門靜脈的分支——小葉間靜脈血提供從胃腸道吸收的葡萄糖、脂肪酸、維生素等營養(yǎng)和藥物成份。氧氣、激素和營養(yǎng)物質(zhì)的血液從肝小葉的門管區(qū)（portal area）進(jìn)入，在肝小葉內(nèi)部血竇（hepatic sinusoid, LU）、竇周隙（persinusoidal space, PS）內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)交換后匯入中央靜脈（central vein, CV）。而經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的膽汁酸則進(jìn)入膽小管從小葉中心向門管區(qū)流動并排出肝臟[4] 。
此前，體外構(gòu)建肝臟類器官主要有肝細(xì)胞膽管類器官、血管化肝類器官和肝臟類器官芯片三種類型，技術(shù)定位于盡可能模擬肝臟的組織構(gòu)造和蛋白質(zhì)合成、膽汁分泌等基本生理功能。
2015年，科學(xué)家用人肝臟分離的原代人EpCAM+細(xì)胞經(jīng)體外懸浮培養(yǎng)成功構(gòu)建出具有典型膽管狀結(jié)構(gòu)肝臟類器官[5]。此后，用人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝祖細(xì)胞經(jīng)三維培養(yǎng)建立了肝臟類器官，不僅具有肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF-4α)、細(xì)胞色素P450 家族1亞家族A1成員 (cytochrome P450 family 1subfamily A member 1, CYP1A1)、白蛋白(albumin)、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C 超家族成員2(ATP-binding cassette subfamily C member 2, ABCC2) 等成熟肝細(xì)胞典型標(biāo)志物，還在解熱鎮(zhèn)痛藥物乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）肝毒性測試中表現(xiàn)出類似于原代肝細(xì)胞（Primary Human Hepatocyte, PHH）的劑量依賴反應(yīng)[6]。
缺少血管循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的肝臟類器官與真實(shí)肝臟生理環(huán)境尚有差距。為此，研究人員進(jìn)行了構(gòu)建具有血管化結(jié)構(gòu)肝臟類器官的嘗試。Takanori Takebe等將iPSC誘導(dǎo)形成的肝內(nèi)胚層細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)共同培養(yǎng)，生成具有三維球狀組織的肝芽(liver bud)——人血管化肝臟類器官。將其移植入免疫缺陷的小鼠體內(nèi)48小時(shí)后,肝芽與宿主血管互連形成復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò), 并實(shí)現(xiàn)血管網(wǎng)有效血液灌注[2,3] 。
在靜態(tài)培養(yǎng)體系構(gòu)建血管化多細(xì)胞類型肝類器官基礎(chǔ)上，近年，肝臟類器官芯片陸續(xù)面世，以適應(yīng)肝癌、非酒精性脂肪肝的基礎(chǔ)研究和高通量抗肝癌藥物篩選體外模型應(yīng)用需求。肝血竇芯片含有類似肝臟的血流環(huán)境和維持肝臟生理功能的多種細(xì)胞類型，可通過微流控技術(shù)動態(tài)調(diào)整液體流量及物質(zhì)輸送。而基于肝小葉的生理結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建包含門靜脈、肝動脈和中央靜脈三條血管通道和六棱柱體式細(xì)胞培養(yǎng)室的肝小葉芯片，不僅具有多樣化細(xì)胞組成類型，還實(shí)現(xiàn)了肝門靜脈和肝動脈實(shí)現(xiàn)雙重供血。運(yùn)用肝小葉類器官芯片首次模擬了非酒精性脂肪性肝病（non -alcoholic fatty liver disease, NAFLD）中肝小葉中的脂質(zhì)分區(qū)進(jìn)展[6] 。
多區(qū)肝臟類器官的研究愿景并建立可用于糖尿病、藥物性肝損傷、酒精相關(guān)肝病等疾病發(fā)病機(jī)制和肝病藥物篩選模型的體外細(xì)胞模型，而是實(shí)現(xiàn)用患者自體細(xì)胞培養(yǎng)出能取代異體捐贈肝臟、直接用于肝移植治療的再生醫(yī)學(xué)目標(biāo)。這要求用人類干細(xì)胞衍生出的肝類器官與人體肝臟組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成類型、代謝功能（包括谷氨酰胺合成、氨代謝、尿素循環(huán)、脂質(zhì)和葡萄糖等）完整性、血液與膽汁流向與人體肝臟的高度一致。
二、多功能區(qū)肝臟類器官組裝體技術(shù)的開創(chuàng)性
血液、膽汁酸從肝小葉外圍的門管區(qū)到中央靜脈區(qū)流動是一個(gè)復(fù)雜物質(zhì)交換過程。沿門管外圍-中央靜脈外圍軸（periportal-pericentral axis），形成氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、激素及代謝廢物濃度的梯度分布區(qū)，即：血流中O2、葡萄糖、膽固醇（Cholesterol）等營養(yǎng)物質(zhì)濃度從肝小葉外緣向中央靜脈方向梯次降低，而激素及氨、膽汁酸(Bile acid)、尿素等代謝物的濃度則在這一方向上漸次升高[4]。
與物質(zhì)濃度梯度分區(qū)模式相應(yīng)的是，肝小葉內(nèi)部的葡萄糖異生作用(gluconeogenesis)、脂肪酸β氧化(β-oxidation)、尿生成(Ureagenesis)、蛋白質(zhì)分泌(Protein secretion)和糖酵解（glycolysis）、脂肪生成（lipogenesis）、谷氨酰胺合成（Glutamine synthesis）等代謝功能，沿著物質(zhì)梯度軸呈現(xiàn)異質(zhì)性（hepatic functional heterogeneity），或稱為代謝通路的空間區(qū)室化（spatial compartmentalization of metabolic pathways）。譬如，門靜脈周圍肝細(xì)胞中糖異生和脂肪酸氧化的活性較高，中央靜脈周圍細(xì)胞中的糖酵解和藥物代謝升高。在哺乳動物肝臟中，肝細(xì)胞的代謝和功能因在肝小葉內(nèi)的位置不同而存在差異，即肝細(xì)胞功能空間異質(zhì)性，稱為肝臟分區(qū)（zonation）?？茖W(xué)界通常將肝小葉內(nèi)部差異化代謝功能區(qū)分為三個(gè)，即圍繞肝動脈和門靜脈區(qū)域的門管周邊區(qū)(periportal areas, zone 1)，靠近中央靜脈的中央靜脈周邊區(qū)(pericentral areas, zone 3)和介于這兩者之間的小葉中間區(qū)(mid-lobular areas, zone 2)。門靜脈區(qū)（1區(qū)）執(zhí)行糖原和膽固醇的合成、膽汁酸代謝和氨轉(zhuǎn)化為尿素的功能，參與糖原儲存和膽汁酸代謝。中央靜脈周邊區(qū)域（3區(qū)）細(xì)胞執(zhí)行CYP450酶主導(dǎo)的解毒和藥物代謝，脂質(zhì)氧化反應(yīng)和谷氨酰胺合成。而處于1、3區(qū)之間的肝小葉中間區(qū)（2區(qū)）為功能過渡區(qū)，兼1區(qū)、3區(qū)部分功能，具肝再生潛能。涉及肝臟分區(qū)的非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞專屬，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和竇周隙的肝星狀細(xì)胞集群同樣呈現(xiàn)出梯度變化，其基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性在不同區(qū)域存在顯著差異[4, 7-8]。
肝小葉內(nèi)部養(yǎng)分與代謝物濃度梯度分布的生理微環(huán)境（microenvironment）塑造了肝細(xì)胞分區(qū)，造成肝分區(qū)細(xì)胞表觀遺傳特征，如DNA甲基化或染色體構(gòu)象的差異，決定了肝細(xì)胞基因表達(dá)譜和生理功能的空間異質(zhì)性。大量研究表明，包括膽紅素、代謝激素、O2、營養(yǎng)物質(zhì)和形態(tài)發(fā)生素(morphogen)濃度等多種因素，通過激活Wnt家族分子（與3區(qū)肝細(xì)胞正確分區(qū)有關(guān)）、Hedgehog和Notch信號通路（與1區(qū)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分區(qū)有關(guān)），調(diào)控了肝臟相關(guān)代謝功能基因的表達(dá)，決定肝細(xì)胞代謝區(qū)帶命運(yùn)[7,8] 。迄今為止，決定細(xì)胞分區(qū)命運(yùn)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子未明確。在體外復(fù)制動物和人類肝臟功能分區(qū)的多細(xì)胞類型類器官的探索，在科學(xué)界尚無先例。
表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，肝臟細(xì)胞的3分區(qū)是由抗壞血酸或膽紅素依賴的內(nèi)源性組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300與甲基胞嘧啶雙加氧酶TET1（通過將 5-甲基胞嘧啶羥化成 5-羥甲基胞嘧啶完成DNA的主動去甲基化修飾）或低缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α)機(jī)制調(diào)控的。L-抗壞血酸（Ascorbic Acid）即維生素C（Vitamin C），可調(diào)節(jié)肝臟1區(qū)多個(gè)特異性肝細(xì)胞基因的表達(dá)，增強(qiáng)包括糖異生、膽固醇合成和脂肪酸氧化等功能，同時(shí)抑制3區(qū)肝細(xì)胞的脂生成。因此，采用穩(wěn)定的抗壞血酸暴露可以促進(jìn)靠近門管區(qū)細(xì)胞特定代謝途徑基因的表達(dá)[1] 。
膽紅素（Bilirubin）是血液中衰老紅細(xì)胞中的血紅素經(jīng)脾臟代謝后生成代謝廢物，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸經(jīng)膽管排放入腸道后隨著糞便排出體外。膽紅素可以直接或通過Wnt信號激活間接促進(jìn)第3區(qū)特異性CYP酶的表達(dá)，增強(qiáng)位于3區(qū)域代謝活動的潛力。膽紅素也能激活HIF1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，模擬低氧條件效應(yīng)，維持第3區(qū)特異性程序的表達(dá)。
基于膽紅素和抗壞血酸能夠通過促進(jìn)表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄程序的發(fā)展而定義了肝細(xì)胞分區(qū)身份的認(rèn)識。研究人員采用L-抗壞血酸（主要靶向1區(qū)細(xì)胞）-膽紅素（主要靶向3區(qū)細(xì)胞）的簡單組合，分別對誘導(dǎo)兩組來自人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)生成肝祖細(xì)胞，再通過共培養(yǎng)的富含抗壞血酸培養(yǎng)基、膽紅素培養(yǎng)基暴露的肝祖細(xì)胞，生成自組裝、精確模擬人體肝臟3分區(qū)細(xì)胞差異性表型的肝類器官組合體，標(biāo)志著在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出準(zhǔn)確模仿人類肝功能的肝組織技術(shù)實(shí)用化邁出了重要一步。移植人類類器官緩解接受膽管結(jié)扎、免疫抑制模型大鼠的高氨血癥和高膽紅素血癥，提高了其生存率。
三、多區(qū)肝臟類器官組裝體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容
多區(qū)肝臟類器官一文實(shí)驗(yàn)部分主要包括人源iPSC干細(xì)胞準(zhǔn)備、Z1區(qū)、Z3區(qū)類器官培養(yǎng)和組合式奪區(qū)類器官構(gòu)建、類器官功能表征的工作[1] 。
3.1類器官的生成
人源iPSC干細(xì)胞材料準(zhǔn)備：
干細(xì)胞材料中的對照組的1383D6 和 RCL-BC iPSCs 由京都大學(xué) CiRA 友情提供。實(shí)驗(yàn)組iPSCs 72.3 和 72.3-GFP 是由陰莖包皮環(huán)切術(shù)廢棄組織分離的成纖維細(xì)胞重編程為 iPSCs，并經(jīng)慢病毒介導(dǎo)mGulo基因敲入改造而來。
類器官生成：
簡言之，將p40 iPSC培養(yǎng)分化后，使用Accutase處理將細(xì)胞解離成單細(xì)胞懸液。將該單細(xì)胞懸液與50%基質(zhì)膠和50% EP培養(yǎng)基混合，并在6孔板中接種后以產(chǎn)生類器官。
多區(qū)域人肝臟類器官組裝體（mZ-HLO）的生成：
分別用低濃度膽紅素、抗壞血酸處理未成熟的類器官生成GLUL+肝細(xì)胞Z3-HLOs，CPS1+肝細(xì)胞的Z1-HLOs，最后將Z3-HLO和Z1-HLOs類器官按數(shù)量1:2的比例共培養(yǎng)生成帶有三個(gè)細(xì)胞區(qū)帶特征的組合式多區(qū)域人肝臟類器官(mZ-HLOs)。收獲的Z3-HLO、Z1-HLOs和mZ-HLOs用于下游表征分析。
3.2 多區(qū)域人肝臟類器官的主要表征內(nèi)容
類器官活細(xì)胞延時(shí)成像：類器官實(shí)時(shí)成像，每30分鐘成像一次，持續(xù)7天，觀察類器官融合需要觀察細(xì)胞骨架、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。
類器官免疫染色成像：類器官免疫組化方法處理，在共聚焦激光掃描顯微鏡上成像。
蛋白表達(dá)檢測：將類器官解離裂解，提取總蛋白用于L-古洛諾內(nèi)酯氧化酶ELISA測定。
肝細(xì)胞代謝物檢測：通過收集用膽紅素處理的HLO的上清液和大鼠的血清，用膽紅素檢測試劑盒測定膽紅素；收集HLO，接種到96孔測定板中，用細(xì)胞抗氧化檢測試劑盒測定細(xì)胞抗氧化水平、氮相關(guān)代謝物(用谷胱甘肽、氨、尿素、谷氨酰胺、葡萄糖和甘油三酯測定試劑盒)測定。
代謝活性檢測：通過收集HLOs，將接種到96孔板中，進(jìn)行細(xì)胞色素P450酶家族中的CYP3A4和CYP1A2藥物代謝酶檢測、細(xì)胞培養(yǎng)上清中人類Notch1信號通路報(bào)告基因檢測、氮代謝相關(guān)酶（谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶和葡萄糖激酶）活性檢測。裂解HLO，用Caspase-3比色檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。
帶狀毒性測定(Zonaltoxicityassay)：HLOs的烯丙醇、3區(qū)乙酰氨基酚毒性、mZ-HLO再生潛力測試，用細(xì)胞裂解物測試Caspase3活性。用CellTiter-Glo熒光細(xì)胞活力測定檢測活細(xì)胞數(shù)量。
基因表達(dá)分析：
對不同分區(qū)細(xì)胞功能基因表達(dá)的RT-qPCR檢測中，Dox誘導(dǎo)的Z1-HLO中ACSS2、ASL、CPS1和OTC基因的表達(dá)水平上調(diào)，抗壞血酸誘導(dǎo)促進(jìn)了Z1-HLO中CPS1+門周區(qū)肝細(xì)胞分化。
RNA-seq是一種高通量測序技術(shù)，能對單個(gè)細(xì)胞、特定功能狀態(tài)下包括mRNA、rRNA、 tRNA、microRNA及其他各種非編碼 RNA(ncRNA)在內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。通過對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以獲得特定樣品基因表達(dá)研究和轉(zhuǎn)錄層面全面信息。RNA-seq分析表明，A1AT、HNF4A 和 CEBPA 等泛肝細(xì)胞標(biāo)志基因在 Z1 和 Z3-HLO 中均一致表達(dá)。Z3-HLO中GHR、BCHE和 RCAN1等中央靜脈區(qū)特異性基因表達(dá)水平高，而 Z1-HLO則表達(dá)ACSS2、SLBP和 RND3。
ChiP-reChIP、ChiP-qPCR和ChIP-seq分析
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是一種用于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互結(jié)合的方法。通常先用甲醛處理活細(xì)胞固定DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再用工具酶將染色質(zhì)切成無數(shù)個(gè)染色質(zhì)小片段，基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理，用抗體將含有目標(biāo)蛋白的染色質(zhì)片段提取富集后，再將結(jié)合的蛋白質(zhì)、DNA解離以獲得純化DNA片段。ChIP與PCR、qPCR聯(lián)用，可確認(rèn)DNA序列與特定蛋白間的結(jié)合。將ChIP與NGS測序結(jié)合（ChIP-Seq技術(shù)），對富集到的全部DNA片段進(jìn)行測序，可在全基因組范圍內(nèi)檢測與特定組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合的潛在DNA位點(diǎn)。ChiP技術(shù)可從研究單一目標(biāo)蛋白與已知靶序列間的結(jié)合，發(fā)展到單一目標(biāo)蛋白與整個(gè)基因組內(nèi)未知序列的相互作用、兩種或多種蛋白復(fù)合物與單一DNA序列的相互作用（即ChIP-reChIP方法，是將第一輪ChIP富集到的蛋白-DNA復(fù)合物繼續(xù)進(jìn)行第二種蛋白的免疫沉淀，從而得到與同一個(gè)DNA序列結(jié)合的兩種不同蛋白）。
通過組蛋白特異性抗體，將帶有特定修飾的組蛋白-DNA復(fù)合物沉淀，獲取的組蛋白可確定組蛋白修飾相關(guān)的DNA特定位點(diǎn)和組蛋白修飾酶靶標(biāo)。因此，ChiP技術(shù)是表觀遺傳學(xué)中檢測轉(zhuǎn)錄因子與特定基因啟動子相互作用，組蛋白乙?；c染色質(zhì)的開放和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方法。
ChIP-seq 分析顯示，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶EP300與mZ-HLO中的7875 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合增加，可乙酰化增強(qiáng)子區(qū)并激活轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝母細(xì)胞分化和干細(xì)胞分區(qū)差異化轉(zhuǎn)錄。
單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）分析
細(xì)胞核RNA中含有大量的非編碼序列，其中包含基因間區(qū)序列和的內(nèi)含子序列。snRNA-seq分析用于單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞核RNA檢測，較好地保持了細(xì)胞原始狀態(tài)和特性，適用于研究細(xì)胞表型鑒定。將snRNA-seq和細(xì)胞軌跡分析結(jié)合，用 snRNAseq 數(shù)據(jù)集表征不同的肝細(xì)胞身份，闡明細(xì)胞功能相關(guān)基因集。而根據(jù)基因的表達(dá)狀況把樣本分為多個(gè)分化狀態(tài)下的細(xì)胞群，生成細(xì)胞譜系發(fā)育樹，可用于預(yù)測細(xì)胞的分化及發(fā)育軌跡。
snRNA-seq分析顯示，與原代肝細(xì)胞snRNAseq數(shù)據(jù)集相比， mZ-HLO中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞群體（除肝母細(xì)胞群體）分區(qū)與肝細(xì)胞群體高度一致。軌跡分析揭示肝臟分區(qū)源于肝母細(xì)胞，肝臟再生過程中，2區(qū)肝細(xì)胞各分區(qū)肝細(xì)胞的主要來源。
3.3多區(qū)肝臟類器官實(shí)驗(yàn)報(bào)告信息與歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)的對比
我們按歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)要求，將《用人多能干細(xì)胞生成的多區(qū)肝臟類器官》可利用的全部信息生成了包含5方面內(nèi)容的多區(qū)肝臟類器官實(shí)驗(yàn)元素?fù)?jù)報(bào)告表。
歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)要求的元數(shù)據(jù)信息 | Nature多區(qū)肝臟類器官實(shí)驗(yàn)報(bào)告信息 |
Section 1. Identification Of The Project | |
Project Title | XX |
Acronym Of The Project (if any) | - |
Type of Organoid | |
Organoid for Basic Research | 是 |
Factoroid (Organoid for Bioproduction) | 否 |
Organoid or Preclinical Research | 否 |
Organoid for Clinical Use | 否 |
Others (If Yes, Specify) | - |
Name of The Organoid | 人多分區(qū)肝臟類器官 |
Purpose of The Project | 作為人類肝臟體外細(xì)胞模型用于與肝臟發(fā)育和疾病相關(guān)的基礎(chǔ)研究 |
Section 2. Source Material | |
Does your research involve human material? | 是 |
If YES： | |
Is the material obtained from volunteers? | 是 |
Has informed consent been obtained? | 是 |
Provide details of the informed consent: | N.A. |
Is the volunteer a patient? | 是 |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
If starting material is obtained from a biopsy, are descriptors known (gender, age, anatomical regions, diagnosis, viral status, etc.)? | 是 |
Please list items. | 性別: 男性 年齡: N.A. 取材所屬解剖區(qū)域：包皮環(huán)切術(shù)后廢棄包皮組織 患者病情臨床診斷：N.A. 病毒感染狀態(tài)：N.A. |
Does the sponsor of the research hold clinical data on the patient? | 是 |
Is the laboratory authorised to prepare and conserve human body elements for scientific purposes? | 是 |
Give details and references of the collection declaration. | N.A. |
Is the starting material a cell line? | 否 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | 京都大學(xué)贈送的1383D6和RCL-BC iPSC：N.A. 患者包皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的72.3 和 72.3-GFP iPSCs：N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of iPSC, permeability test for epithelial cell, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | N.A. |
Are cell type markers identified (example: marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known. | N.A. |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids defined? | / |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Is the starting material primary cells from patients? | 是 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of IPSC, permeability tests for epithelial cell, etc.). | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | / |
Are cell type markers identified (e.g. marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known? | 原代 |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids known? | 原代 |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities). | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Are the cell culture conditions precisely described? | 是 |
If YES： | |
Are the culture conditions well defined? | CO2培養(yǎng)箱工作參數(shù)：37℃、5% CO2和95%空氣 |
Provide details of culture conditions (composition of culture media, nature, origin and quantities of supplements used - e.g. glucose, serum, antibiotics, growth factors etc.) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Are the nature and treatment of the substrates well described? | 是 |
Are the seeding conditions well described? | 是 |
Is the frequency of media changes defined? | 是 |
Are O2/CO2 concentrations given? | 是 |
Provide details of the culture conditions | CO2培養(yǎng)箱工作參數(shù)：37℃、5% CO2和95%空氣 |
What are the storage conditions for the lines or cells? | -80℃超低溫保存 |
Are there cell master banks? | N.A |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are there cell working banks? | 是 |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are storage conditions indicated? | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the freezing and thawing protocol. | N.A |
Are the storage modalities given? | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Please specify. | 同上 |
Section 3. Manufacturing of The Organoid | |
Does the project include 2D differentiation? | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments. | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形態(tài)學(xué)：N.A.;材料均勻性：N.A;最大和最小匯合：N.A. 細(xì)胞增殖：N.A. 功能測試：N.A.;標(biāo)記物監(jiān)測：N.A. 細(xì)胞的分類：N.A.;細(xì)胞死亡率：N.A. |
Does the project include the generation of (3D) organoids? General considerations | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.). | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes. | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形態(tài)學(xué)：N.A.，材料均勻性：N.A. 最大和最小融合度：N.A.，細(xì)胞增殖：N.A. 功能測試：見原文[Method]一節(jié) 標(biāo)記物監(jiān)測：見原文[Results]“Multi-Zonal Human Liver Organoids via assembly of Z1- and Z3-HLOss” 細(xì)胞的分類：見原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” 細(xì)胞死亡率：N.A. |
Does organoid generation make use of matrices? | 是 |
If YES： | |
Describe the nature of the matrix (matrigel, hydrogels, hyaluronic acid, human decellularized matrix, etc.) | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Give the matrix concentration. | 同上 |
Give details of the preparation method (temperature, polymerization time, drop or layer structure, etc.). | 同上 |
Give the seeding density per matrix volume unit. | 同上 |
Specify the volume and number of drops of matrix per unit area in the culture medium. | 同上 |
Specify the amount of medium depending on the size of the well. | 同上 |
Describe the matrix dissociation method for organoid recovery. | 同上 |
Describe the organoid dissociation method used for their expansion. | 同上 |
Does the culture include multiple cell types? | 是 |
If YES： | |
Describe the sequence for co-culturing and adaptation of the co-culture media. | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate the proportions of cell types. | 見原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” |
Section 4. Organoid Characterisation | |
Has a morphological/structural characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Describe the appearance, size, shape [circularity, tubularity, regularity of contours (budding), etc.]. | 熒光顯微鏡 BZ-X810成像，用Fiji（v1.53f）對圖像進(jìn)行形態(tài)測量和測定 |
Evaluate opacity/ refringency. | N.A. |
Quantify intra and inter-organoid homogeneity. | N.A. |
Give details of expected morphological, architectural and ultrastructural features, and organisation of cell types (identity, proportions, distribution). | 1）形態(tài)、結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)特征：N.A. 2）細(xì)胞組成類型、比例：SERPINA1 肝細(xì)胞 (55%)、KRT7 膽管細(xì)胞(11%)、PECAM1 內(nèi)皮細(xì)胞(12%)、LYZ 巨噬細(xì)胞(7%)、COL1A1 星狀細(xì)胞(7%)和 CD44 間充質(zhì)細(xì)胞(8%) |
Has a molecular characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Provide elements of genomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics. | 轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測元數(shù)據(jù)：RT-qPCR, RNA-seq, snRNA-seq 表觀遺傳學(xué)檢測元數(shù)據(jù)：ChiP-qPCR、ChIP-seq |
Indicate expected specific molecular markers, epigenetic characteristics. | 特異性分子標(biāo)記物：見原文Fig. 1g. 表觀遺傳特征：RNA-seq、ChIP-seq 和 snRNA-seq 數(shù)據(jù)已存入GEO，登錄號GSE222654。 |
Has a functional characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
What are the qualitative and (if possible) quantitative functional characteristics? | 見原文[Method]一節(jié) |
If treatments are applied, detail the treatment protocol, response to treatments (pharmacological, chemical, physical, hormonal, etc.), and evaluation (quantitative or qualitative). | 見原文[Method]“Zonal toxicity assay”、Extended Data Fig. 11. |
Are traceability and organoid drift evaluated? | 是 |
If YES： | |
Describe how the traceability of components is evaluated (batches, suppliers etc., environments, complements). | 見原文[Method] “mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance、Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate criteria for the traceability of conditioned media (drift of cells used for conditioning, control of lines, such as those at the origin of the organoid) control of at least one of the growth factors). | 同上 |
Describe the qualitative drift criteria (morphological, structural, functional, molecular, etc.) specific to each organoid. Specify indices if applicable. | N.A. |
How is robustness evaluated (same starting cells, same organoid)? Specify indices if applicable. | N.A. |
Section 5. Use Of Organoids | |
Are the organoids designed for basic research? | 是 |
If YES： | |
Is compliance with GLP required for organoid production? | 否 |
Give details, if applicable. | / |
與歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)的對照顯示，多區(qū)肝臟類器官一文所披露的類器官實(shí)驗(yàn)元數(shù)據(jù)并不完善。表中凡標(biāo)記為N.A.的條目，不查閱作者公開發(fā)表的其它類器官研究報(bào)告等外部材料情況下，單從該報(bào)告是無法獲知詳情的。
為確保類器官實(shí)驗(yàn)起始材料的性狀一致性，MIAOU標(biāo)準(zhǔn)的“Section 2材料來源”部分對干細(xì)胞材料要求提供接收時(shí)干細(xì)胞傳代（passages）的代數(shù)、細(xì)胞系分子遺傳信息、生物標(biāo)志物及是否經(jīng)過干細(xì)胞多能性驗(yàn)證的信息。此外，在培養(yǎng)維持干細(xì)胞材料時(shí)，規(guī)定要注明樣品經(jīng)過支原體/細(xì)菌學(xué)/真菌感染檢測陰性的結(jié)果。然而在多區(qū)肝臟類器官一文中，讀者除根據(jù)常識可以判斷人體材料捐獻(xiàn)者系男性，為陰莖包皮環(huán)切術(shù)廢棄組織外，患者年齡、手術(shù)時(shí)疾病診斷信息、是否有遺傳病及病毒感染等MIAOU標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定信息都無從可考。合作單位惠贈的iPSCs的傳代（passages）的代數(shù)、細(xì)胞系遺傳信息、生物標(biāo)志物等信息及查詢途徑均未作說明，對細(xì)胞培養(yǎng)過程中樣品及培養(yǎng)環(huán)境是否經(jīng)支原體/細(xì)菌學(xué)/真菌感染檢測為陰性結(jié)果亦無明確備注。
“Section 3 類器官的生成”部分，無論是細(xì)胞2D培養(yǎng)、3D培養(yǎng)操作過程，缺少傳代操作的時(shí)細(xì)胞融合度范圍區(qū)間、細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（從活細(xì)胞比率可計(jì)算出死細(xì)胞比率）等重要信息。此外，未對倒置顯微鏡相差模式下的細(xì)胞形態(tài)提供必要文字說明，也無超微結(jié)構(gòu)（一般指的是電鏡圖片）特征信息描述?！?span style="color: rgb(63, 63, 63); font-family: 微軟雅黑,Microsoft YaHei; font-size: 14px;">Section 4 類器官的表征”工作，只提供了細(xì)胞標(biāo)志物熒光圖像資料，缺少對具有質(zhì)控意義的細(xì)胞功能、活力和表觀遺傳學(xué)特征指標(biāo)的明確說明。
多區(qū)肝臟類器官一文研究團(tuán)隊(duì)有十余年類器官研究的成功經(jīng)驗(yàn)。如此雄厚技術(shù)實(shí)力背景下，報(bào)告中出現(xiàn)MIAOU標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的類器官材料元數(shù)據(jù)要素的缺失，顯然絕非實(shí)驗(yàn)資源條件受限所致，而應(yīng)歸結(jié)為研究團(tuán)隊(duì)對類器官實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部要求與歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的不一致。這也恰恰反映了當(dāng)今的歐盟、美國和日本乃至全球科學(xué)界，在類器官研究技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的現(xiàn)狀。
另一方面，通過對照也反映出歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)自身的技術(shù)局限性。
一是其中部分環(huán)節(jié)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置值得商榷。特定的原代細(xì)胞、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞株，在不同培養(yǎng)維持和誘導(dǎo)條件、多次傳代操作過程中，與其說要注意防范基因突變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，不如重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞因培養(yǎng)環(huán)境改變后細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征偏差的可能性。以本文所討論的研究項(xiàng)目為例，相同遺傳背景的肝臟類器官在不同化合物誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞基因表達(dá)表現(xiàn)出明顯的空間差異化特征。文中沒有提供任何的細(xì)胞基因組、關(guān)代謝相關(guān)功能基因序列或STR測試數(shù)據(jù)信息。因此，規(guī)定所有實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)所用的細(xì)胞材料須提供DNA序列、SNP分析、PCR檢測、STR位點(diǎn)等基因序列信息作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)就不盡合理，給研究工作平添額外開支和工作負(fù)擔(dān)。此外，實(shí)驗(yàn)前須進(jìn)行iPSC多能性分化實(shí)驗(yàn)或上皮細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)，不僅會消耗部分寶貴的細(xì)胞材料資源，還會造成本已耗時(shí)冗長的類器官培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步拉長。因此，MIAOU標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該仿照實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告的MIQE指南，對列出的要素信息按其重要程度實(shí)施分級管理，可能更合理和具有可行性。
其二，MIAOU標(biāo)準(zhǔn)，視乎主要是針對常規(guī)類器官、類器官芯片而設(shè)置的。盡管HYBRIDA項(xiàng)目已將的類器官組裝體、嵌合型類器官納入監(jiān)管視線，但目前看，并不能完全適應(yīng)更復(fù)雜的類器官組裝體操作、表征和質(zhì)控管理的要求。
這么一說，我們真有點(diǎn)期待歐盟的MIAOU 2.0標(biāo)準(zhǔn)了。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Reza, H.A., Santangelo, C., Iwasawa, K. et al. Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-08850-1
[2] Takanori Takebe, Keisuke Sekine, Masahiro Enomura, et al．Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant．Nature, 2013;499(7459):481-4.
[3] Takebe T, Zhang RR, Koike H, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nat Protoc, 2014, 9: 396-409
[4] Rory P Cunningham, Natalie Porat-Shliom. Liver Zonation – Revisiting Old Questions With New Technologies. Front Physiol, 2021;12:732929.
[5] Sato T, Vries R G, Snippert H J, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459(7244): 262-265.
[6] 蘇軍,公一,周佳菁，徐祎春,韓峻松.肝臟類器官芯片在生物醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展.生命科學(xué), 2023; 35(2):241-249.
[7] Shani Ben-Moshe, Shalev Itzkovitz. Spatial heterogeneity in the mammalian liver. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019;16(7):395-410.
[8] Carmen Bravo González-Blas, Irina Matetovici, Hanne Hillen, et al. Single-cell spatial multi-omics and deep learning dissect enhancer-driven gene regulatory networks in liver zonation. Nat Cell Biol, 2024;26(1):153-167.
[9] D5.1: Operational guidelines regarding organoids and organoid-related technologies (https://hybrida-project.eu/)
