類器官，是指用來自胚胎、細胞重編程誘導、人體或動物組織的干細胞/祖細胞，在體外經(jīng)培養(yǎng)擴增、誘導分化后，自我組裝生成具有特定器官的細胞譜系構(gòu)成、可模擬在體動物臟器的一些基本功能活動特征的三維結(jié)構(gòu)細胞簇，屬于體外細胞模型的范疇^[1] 。

       2009年，荷蘭科學家Hans Clevers團隊首次利用表達富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)的小鼠腸道干細胞在體外培養(yǎng)出具有隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸組織，標志著類器官技術(shù)正式誕生^[2] 。此后，包括腸道^[3] 、結(jié)腸^[4] 、視網(wǎng)膜^[5] 、甲狀腺^[6] 、胰腺^[7] 、大腦^[8] 、食道^[9] 、前列腺^[10] 、胃^[11] 、肝臟^[12-13] 、腎臟^[14] 、輸卵管^[15] 、唾液腺^[16] 、子宮內(nèi)膜^[17-18] 、乳腺^[19] 、肺^[20] 、血管^[21] 、皮膚^[22] 、心臟^[23]等，數(shù)十種人類器官相繼開發(fā)問世，引起了科學、產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注。

       類器官實驗技術(shù)方法的成功探索，被視作推進生物學研究的重大突破，先被Nature Methods評為2017年度技術(shù)，登上2019年Science雜質(zhì)的封面，還被《新英格蘭醫(yī)學雜志》（The New England Journal of Medicine，NEJM）評為優(yōu)良的人類臨床前疾病模型。 

一、類器官相關(guān)技術(shù)研究應用基本現(xiàn)狀

       與常規(guī)2D 細胞培養(yǎng)物比，類器官具有真實器官類似的細胞組成、結(jié)構(gòu)和部分功能活動，可還原體內(nèi)細胞分化與細胞遷移，以及細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)復雜的相互作用。類器官的形成過程本身即是對組織器官真實發(fā)育過程的模擬。因此，類器官為科學家理解組織器官發(fā)生、早期發(fā)育等關(guān)鍵問題打開了一扇新的窗戶。研究人員用大腦類器官構(gòu)建了人類大腦發(fā)育的多組學圖譜，揭示了人腦早期發(fā)育過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡^[24] ；而依托人類干細胞構(gòu)建的囊胚、原腸胚等早期胚胎類器官，人們可直觀地觀察到胚胎的整體構(gòu)造和早期發(fā)育過程，揭開了人類胚胎發(fā)育階段的“盲盒” ^[25] 。

       在疾病致病機理研究方面，通過干細胞受控定向分化、基因編輯方法，類器官技術(shù)有望解決疾病模型缺乏、動物建模難題，為人類特有的、罕見病、遺傳性疾病、癌癥和傳染病等疾病的發(fā)生發(fā)展機制等研究、探索新治療靶點和新療法提供了全新機遇。譬如，SARS-CoV-2重度感染者除呼吸癥狀，代謝、心臟、神經(jīng)、腸胃系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)也困擾著醫(yī)學界。為驗證SARS-CoV-2對除肺部以外其他器官的靶向性和并發(fā)癥的發(fā)生機制，研究人員就用各種類器官模型開展了模擬感染的實驗研究^[26] 。

       采用患者自身組織細胞分離的干細胞培養(yǎng)、誘導和定向分化可生成的與患者器官表型相同的類器官。類器官技術(shù)與與CRISPR-Case9基因組編輯技術(shù)相結(jié)合，可進行患者有缺陷的基因而提供“健康基因”表型的類器官，作為再生醫(yī)學(regenerative medicine)生物材料來源，進行自體移植，可有效規(guī)避免疫排斥反應和規(guī)避致瘤性（Oncogenicity）風險。目前已從小鼠和人類多能干細胞中重建了三維腎小管和腎小球，有望將為尿毒癥晚期患者實施腎移植方案所需的腎臟來源障礙開辟了一條全新途徑。而在個性化醫(yī)療（Personalized medicine）模式背景下，患者來源的類器官（Patient Derived Organoid，PDO）作為先進療法藥品（Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP），正越來越多地被用作為病人量身設計最佳治療方案的工具^[1] 。

       生成類器官所用的各種干細胞材料可長期穩(wěn)定儲存、培養(yǎng)、傳代和擴增，且實驗條件、操作流程易于標準化。細胞材料遺傳背景可長時間保持穩(wěn)定，確保類器官的生產(chǎn)的穩(wěn)定性、可持續(xù)性和高通量的優(yōu)勢。同時，研究人員能實時直觀簡便觀察類器官及細胞內(nèi)部動態(tài)、微妙變化。作為藥物發(fā)現(xiàn)和篩選平臺，類器官避免了動物實驗與人體的種屬差異，能夠更準確、更快捷提供藥物在人體內(nèi)的有效性和毒性實驗數(shù)據(jù)，便于在第Ⅰ期人類臨床藥物試驗前，將藥物安全性和有效性測試融合進行。臨床志愿者因此而免于承擔無效藥物的副作用和安全風險，這將縮短臨床前試驗與臨床試驗的周期，大幅降低藥物開發(fā)投入^[27] 。因此，類器官技術(shù)作為一種全新的體外模型，將直接推動藥物研發(fā)模式的新一輪變革。

       當前，業(yè)界已建立起多種用于藥物篩選的類器官技術(shù)體系，并在藥物研發(fā)領域應用進入產(chǎn)業(yè)化階段。譬如，科學家通過構(gòu)建多囊腎病類器官平臺，實現(xiàn)了囊腫形成抑制化合物的高通量篩選。癌癥藥物開發(fā)領域，已構(gòu)建起大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多種癌癥的類器官庫，既保持腫瘤的異質(zhì)性，又較好展示腫瘤對藥物的敏感性。輝瑞、賽諾菲、阿斯利康等大型藥物企業(yè)在新藥研發(fā)中引入類器官技術(shù)平臺，實現(xiàn)藥物研發(fā)流程優(yōu)化^[26] 。

       據(jù)報道，2015 年以來，全球類器官技術(shù)相關(guān)研究文獻和專利數(shù)量呈爆發(fā)式增長。2010-2021年間，全球672 項類器官相關(guān)專利主要由中國、美國和韓國申報，其中79.46%屬類器官的構(gòu)建、制備和維持相關(guān)技術(shù)^[26] 。

       從肝類器官研究論文發(fā)表數(shù)量看，從2020年開始，論文的數(shù)量進入快速增長期，且呈逐年遞增趨勢。2024年論文總數(shù)為711篇，2025年1-4月份發(fā)文總數(shù)達到214篇，幾乎相當于2019年全年發(fā)文量（見圖3）。

二、類器官模型的主要類型

       目前已報道的“類器官”或與類器官相關(guān)體外三維細胞模型，大致可歸為以下7種類型^[1] 。

1）腸道類器官（intestinal organoid）

       腸道類器官可患者腸組織活檢（intestinal biopsies）分離的Lgr5+腸道干細胞(intestinal stem cells, ISCs)在體外培養(yǎng)擴增形成。它具有腸隱窩（intestinal crypt）形狀的空心對稱球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有完整的腸道上皮結(jié)構(gòu)，含有包括腸上皮細胞、腸內(nèi)分泌細胞、杯狀細胞、潘氏細胞(Paneth cell)和Lgr5+干細胞在內(nèi)成人腸道中發(fā)現(xiàn)的所有細胞類型^[2] 。

       目前的腸道類器類器官盡管可模擬體內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境下干細胞及其分化細胞的相互作用，但無法呈現(xiàn)器官組織損傷再生狀態(tài)下的變化。這是由于在真實體內(nèi)環(huán)境下組織損傷誘導的再生過程中，是由損傷態(tài)腸道干細胞來主導組織損傷修復過程。而如何穩(wěn)定地捕獲并維持損傷態(tài)干細胞亞群，是類器官研究及應用面臨的重要挑戰(zhàn)。研究人員在常規(guī)小腸類器官模型基礎上，通過建立包含有VPA、EPZ6438、LDN193189 和 R-Spondin 1等8個小分子化合物組成的培養(yǎng)條件，誘導小腸類器官細胞損傷再生相關(guān)基因表達，并生成更復雜的三維結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)真實條件下腸道損傷再修復過程出現(xiàn)的“增生態(tài)”隱窩非常相似——增生態(tài)小腸類器官(hyperplastic intestinal organoids, Hyper-organoids)。Hyper類器官的擴增能力得到極大增強：連續(xù)培養(yǎng)5代之后，小腸干細胞數(shù)量提升近10000倍，并在長期傳代擴增中保持基因組的穩(wěn)定性。這一新型類器官模型，解決了類器官技術(shù)在體外無法模擬損傷再生條件下器官和組織變化的難題，同時具備在體外高效擴增和長期維持的能力，為潰瘍性腸炎結(jié)腸上皮修復、建立疾病損傷模型和藥物篩選提供了新的途徑^[28] 。

2）神經(jīng)類器官(Neural organoid)

       患者來源的成纖維細胞^[29] 、淋巴母細胞樣細胞系（Lymphoblastoid cell lines, LCL) ^［30］或人外周血外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC) ^［31］被重新編程后成為誘導多能干細胞(induce pluripotent stem cells, iPSCs)——誘導神經(jīng)元祖細胞（NPC）分化構(gòu)建的3D神經(jīng)類器官，可模擬人體腦神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能、了解大腦發(fā)育或神經(jīng)發(fā)育過程，對于深入理解神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機制以及開展藥物篩選和轉(zhuǎn)移實驗提供新的手段。因缺少有效人源性細胞模型，重性抑郁癥(MDD)患者自殺行為發(fā)生機制研究一致無法進行。而利用攜帶患者來源的iPSCs分化為GABA能中間神經(jīng)元 (GABAergic interneurons, GINs) 和包含GIN的腹側(cè)前腦類器官進行研究揭示了人類神經(jīng)元和腹側(cè)前腦類器官中MDD相關(guān)的重要細胞表型，為確定治療方法提供了新的思路。

3）腫瘤類器官(Tumor organoids)

       從患者腫瘤組織中分離的癌細胞體外擴增生成的腫瘤類器官稱為患者來源腫瘤類器官（Patient-derived tumor organoids, PDTOs），具有與原始親代腫瘤近似一致的三維結(jié)構(gòu)、基因譜系和病理學特征，能較準確地模擬腫瘤在體內(nèi)的微觀形態(tài)^[32] ，克服患者來源癌細胞(Patient-derived cancer cells, PDCs) 、患者來源腫瘤異種移植(patient-derived xenografts, PDXs)模型細胞多樣性不足的缺陷，可用于癌癥建模、個體化治療、腫瘤藥物篩選、腫瘤免疫治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學應用^[33] 。

       自2011年首次成功構(gòu)建結(jié)直腸癌類器官以來，研究人員已經(jīng)構(gòu)建出前列腺、腸道、胃、肝臟、胰腺、乳腺、膀胱和大腦等多種高發(fā)病率、高死亡率人類腫瘤類器官并實現(xiàn)商業(yè)化應用^[32] 。膽囊癌(Gallbladder carcinoma, GBC) ^[34]等相對少見的惡性腫瘤模型也以陸續(xù)建立。有利于推動惡性腫瘤的分子致病機制研究、發(fā)現(xiàn)腫瘤新治療靶點和個性化抗腫瘤化合物的開發(fā)。

4）類器官胚胎模型(Embryonic model)

       通過干細胞衍生的胚狀體和類器官并整合生物工程技術(shù)，科學家們能夠部分重現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中細胞譜系多樣化和組織形態(tài)發(fā)生的發(fā)育事件，包括長距離組織模式和形態(tài)動力學、組織間的相互作用，以及有機體級別的組織和功能^[35] 。

5）類器官芯片(Organoid-on-chip)

       類器官芯片發(fā)源于器官芯片（Organ-on-chip），同屬于微生理系統(tǒng)（Microphysiological System, MPS）范疇。微生理系統(tǒng)是一種體外構(gòu)建的細胞培養(yǎng)平臺，用于對人類、動物的特定組織或器官功能特征進行體外建模，可精細調(diào)控細胞生長的微環(huán)境和微流體流動條件，模擬組織器官的病理生理變化^[36] 。

       器官芯片則是專指在芯片上構(gòu)建的微生理系統(tǒng),是以工程化微流控裝置（microfluidic devices）為核心, 結(jié)合細胞生物學、生物材料和工程學等技術(shù)方法構(gòu)建的包含有多種活體細胞及功能組織界面、生物流體和機械力刺激等因素，可反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征的組織器官體外模型。最早開發(fā)的器官芯片為2010年創(chuàng)建的肺芯片，是一種載玻片大小的雙層夾膜結(jié)構(gòu), 一側(cè)用于氣流通過, 另一側(cè)用于培養(yǎng)液通過。中間多孔的PDMS膜兩側(cè)分別培養(yǎng)氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞, 從而達到模擬人體肺泡的氣液界面的效果。肺芯片的兩側(cè)以循環(huán)抽真空方式拉扯PDMS膜,使細胞受到類似肺牽張作用, 模擬肺泡呼吸的效果。平面2D培養(yǎng)細胞存在難以有效模擬組織器官在體生理特性的缺陷。因此，用體外3D培養(yǎng)的類器官替代器官芯片中傳統(tǒng)2D培養(yǎng)細胞就成為器官芯片技術(shù)進步的必然選擇^[37] 。

       類器官芯片正是用三維(3D)細胞或類器官取代器官芯片中的二維(2D)細胞的方法推陳出新（相當于舊瓶裝新酒）建立的新模型。采用嵌入水凝膠基質(zhì)中的HepG2和NIH-3T3細胞的共培養(yǎng)物形成肝臟類器開發(fā)的藥物篩選的微流控類器官芯片MODS，被成功用于不同濃度對乙酰氨基酚對細胞凋亡和壞死影響的藥物早期肝毒性實驗。研究顯示，HepG2細胞和NIH-3T3細胞在水凝膠3D環(huán)境下培養(yǎng)，表現(xiàn)出成纖維細胞依賴性收縮行為，與同類2D細胞培養(yǎng)相比，白蛋白分泌譜和細胞色素P450 3A4活性更能好地模擬體內(nèi)肝組織的功能狀態(tài)^[38] 。

       與常規(guī)基于超低吸附表面的多孔細胞培養(yǎng)板實施的3D類器官培養(yǎng)模式比，類器官芯片依托微流控裝置構(gòu)建，流道、培養(yǎng)腔均為毫米尺度規(guī)格，可以控制單個細胞凝膠團運動，可讓單個類器官的差異性研究成為可能，適合藥物濃度梯度實驗和不同對照實驗，不僅大幅節(jié)省實驗過程類器官和試劑材料用量[23]。而一個芯片上將多個培養(yǎng)腔集成，則成倍提高實驗通量。而微流控技術(shù)控制細胞培養(yǎng)基、氣體的輸送供應，免除了類器官芯片的培養(yǎng)液定期更新的人工操作。最關(guān)鍵一點是，微流控控制模式，改善了傳統(tǒng)靜態(tài)類器官培養(yǎng)方式中營養(yǎng)代謝物交換擴散效率低下的問題，類器官隨時處于穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)條件中（正所謂：問渠哪得清如許，唯有源頭活水來）。

       此外，在單一類器官芯片基礎上，還可以將種類器官集成在一個芯片上，為設計開發(fā)多臟器類官芯片和人體仿真芯片成為可能^[37] 。

6）類器官組裝體(Assembloid)

       類器官組裝體是指將多個不同細胞類型構(gòu)成或組織類型的類器官置入同一個培養(yǎng)體系實施共同培養(yǎng)生成具有復雜結(jié)構(gòu)的復合型類器官，模擬體內(nèi)真實器官的組織結(jié)構(gòu)、發(fā)育特點。如一個腦類器官與一個肌肉類器官相連，以模擬肌肉組織的神經(jīng)支配(innervation)。以腸道和胃類器官耦合以模擬消化道(gastrointestinal tract)。
        人腦類器官組裝體是通過組裝兩個或更多腦區(qū)特異性類器官或?qū)⑵渌V系細胞整合到腦類器官中而成的復雜結(jié)構(gòu)，能夠反映器官與器官或器官與細胞的相互作用，模擬更復雜的神經(jīng)發(fā)育過程，作為研究神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能的人源性模型，對深入理解神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機制以及開展藥物篩選具有特殊價值^[39] 。研究人員用人源誘導性多能干細胞分別建立了大腦皮層、脊髓組織和骨骼肌的三種組織球體，以脊椎球體為中心將三種球體按皮質(zhì)-脊髓-骨骼肌順序相鄰排列在培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)后，三種球體逐漸融合并使自我精確組裝，衍生出含大腦皮層、脊髓和骨骼肌的3D 皮質(zhì)運動組合體^[40] 。
       用低濃度膽紅素、抗壞血酸處理未成熟的類器官生成GLUL+肝細胞Z3-HLOs、CPS1+肝細胞的Z1-HLOs，將Z3-HLO和Z1-HLOs類器官按數(shù)量1:2的比例共培養(yǎng)生成帶有三個細胞區(qū)帶特征的組合式多區(qū)域人肝臟類器官(mZ-HLOs) ^[12] 。

7）類器官異種嵌合體(interspecies Chimera)

       類器官嵌合體是將一個物種細胞生成的類器官人工植入到異種動物體內(nèi)的研究模型。如將體外培養(yǎng)生成的人類器官移植到動物體內(nèi)，以在模擬類器官生長發(fā)育依賴的組織微環(huán)境條件，以促進其進一步發(fā)育和生理整合，改善血管化形成和類器官的成熟度(maturation)。2022 年，研究人員突破性地實現(xiàn)了人類大腦類器官與大鼠大腦的連接，使得人類神經(jīng)元與大鼠神經(jīng)元的突觸建立連接，并控制大鼠的行為^[41] 。在此基礎上，將人腦類器官植入視覺皮質(zhì)受損的大鼠腦部，不僅成功實現(xiàn)了人- 鼠腦的整合，并對視覺刺激產(chǎn)生反應，邁出了利用腦類器官修復受損大腦的第一步^[42] 。

       通過多能干細胞注射進行囊胚互補被認為是產(chǎn)生異種器官的最有前途的方法。但倫理規(guī)范限制了對胚胎發(fā)育晚期人類嵌合體的研究。靈長類動物胚胎干細胞具有與人ESC相似的多能性，是研究種間嵌合體和器官生成的良好模型。但靈長類動物ESC是否可用于異源性移植不清楚。中國科學院的研究團隊采用一種優(yōu)化的培養(yǎng)基，增強了食蟹猴 （Macaca fascicularis） 胚胎干細胞（cmESCs）的抗凋亡能力并改善了嵌合胚胎的發(fā)育，將馴化的食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎干細胞（cmESCs）注射到豬囊胚中所得的嵌合胚胎后，可分化成全部三個胚層的細胞。并在所得的新生異種間嵌合體觀察到組織特異性cmESCs分化，表明cmESCs能夠在豬模型中整合和分化為功能細胞。因此，類器官異種嵌合體展現(xiàn)了通過種間囊胚互補在大型動物模型中產(chǎn)生人體組織器官的技術(shù)可行性和再生醫(yī)學技術(shù)發(fā)展應用的前景^[43] 。

三、類器官技術(shù)研究應用目前面臨的主要困境

       盛名之下，其實難副。盡管類器官的研究和開發(fā)應用目前在科研和制藥界如今可謂炙手可熱，但類器官技術(shù)體系尚未完全成熟^{[25, 26, 32]} 。拋開構(gòu)建類器官或類器官芯片的細胞來源、具體目標器官類型（組織類器官\類器官芯片\多器官芯片）、研究目的（基礎研究\臨床前研究\臨床應用研究\生物生產(chǎn)）和類器官技術(shù)應用所涉及的倫理問題，還存在多個難題有待突破。

3.1 目前多數(shù)類器官對靶器官的還原程度還不夠高

       在體的器官均是各種細胞類型的集合體，細胞與周圍微環(huán)境之間存在多向相互作用，參與組織形成、維持穩(wěn)態(tài)和功能穩(wěn)定。而類器官培養(yǎng)體系中微環(huán)境相關(guān)細胞成分缺乏，類器官缺少有效的神經(jīng)支配、毛細血管網(wǎng)絡及相應的血管循環(huán)結(jié)構(gòu)、免疫微環(huán)境，則難以完全重現(xiàn)各種器官的整體結(jié)構(gòu)、細胞組成、真實器官所處生理環(huán)境和一些重要的生理過程^[1] 。常規(guī)類器官靜態(tài)培養(yǎng)體系中，由于缺乏功能性循環(huán)系統(tǒng)，物質(zhì)交換完全依賴物質(zhì)在培養(yǎng)基質(zhì)中的被動擴散而效率低下。隨著類器官體積快速增長，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣向中心區(qū)域的擴散能力逐漸下降，中央?yún)^(qū)域細胞因物質(zhì)交換不良而出現(xiàn)細胞壞死^[26] 。在1-3個月的類器官培養(yǎng)過程中，每2 – 3天需更換培養(yǎng)基、每5 – 7日安需傳代1 次。盡管耗費大量人力實驗材料，類器官內(nèi)細胞的活力依然不足，類器官體積受限（大部分類器官尺寸為微米至毫米級，腫瘤類器官直徑通常為100 ~ 500μm，3D懸浮培養(yǎng)中生長的腦類器官球體可以達到3-4mm直徑），限制了類器官的結(jié)構(gòu)與功能完整性、發(fā)育成熟度和類器官培養(yǎng)傳代的穩(wěn)定性^[25,26] 。

       為此，在大腦皮層類器官研究中，開發(fā)了切片新皮質(zhì)類器官系統(tǒng)（sliced neocortical organoid system, SNO），將類器官置于帶抗CO2振蕩搖床的CO2培養(yǎng)箱或旋轉(zhuǎn)生物反應器中培養(yǎng)，并與類器官切片方法相結(jié)合，以克服培養(yǎng)基物質(zhì)交換擴散極限，SNO培養(yǎng)系統(tǒng)中的類器官可以維持長達一年，極大地促進大腦皮質(zhì)類器官發(fā)育，特別適合人腦皮質(zhì)發(fā)育和精神疾病中調(diào)節(jié)人類皮層神經(jīng)元亞型命運的分子機制的研究^[44] 。

       而針對常規(guī)CO2靜態(tài)培養(yǎng)條件體系中，采用多種細胞成分共培養(yǎng)的方法以重構(gòu)體內(nèi)的細胞微環(huán)境是較為流行的策略。如類器官與血管內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）共培養(yǎng)實現(xiàn)類器官血管化，可復制出與真實器官高度相似的內(nèi)部環(huán)境。在超低吸附培養(yǎng)板中將血管內(nèi)皮細胞、多能干細胞以及多能干細胞來源的肝內(nèi)胚層細胞共培養(yǎng)，成功生成了具有自發(fā)血管網(wǎng)絡的肝臟類器官，能更真實地反映肝臟類器官的發(fā)育或病理狀態(tài)，為研究肝臟生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展機制提供了新途徑^[45] 。子宮內(nèi)膜是一種多細胞組織，它包括構(gòu)成子宮內(nèi)膜表面的單層柱狀上皮細胞和位于腔上皮下方的管狀腺上皮組成。缺乏具有典型腔上皮樣結(jié)構(gòu)以及與體內(nèi)子宮內(nèi)膜解剖結(jié)構(gòu)類似的體外模型，是深入研究不孕癥和復發(fā)性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜疾病等疾病的最大障礙。研究人員首先通過一系列實驗優(yōu)化上皮細胞和基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的最佳比例，并改善了培養(yǎng)類器官的細胞外基質(zhì)，使之物理硬度及生理環(huán)境更利于子宮內(nèi)膜細胞的生長發(fā)育，用氣液界面培養(yǎng)方法（模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜腔面僅被黏液層覆蓋的上皮結(jié)構(gòu)的特殊體內(nèi)環(huán)境），最終形成包含腔上皮、腺上皮及基質(zhì)細胞的內(nèi)膜類器官，準確再現(xiàn)了體內(nèi)子宮內(nèi)膜的細胞組成、解剖結(jié)構(gòu)和月經(jīng)周期性變化等特征^[18] 。

3.2 類器官培養(yǎng)存在對非人源成分細胞外基質(zhì)過度依賴的瓶頸

       類Matrigel基質(zhì)膠是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜混合物。在室溫條件下，Matrigel聚合成具有一定孔隙和剛性的三維基質(zhì)，可模擬體內(nèi)細胞基底膜的組成結(jié)構(gòu)、物理特性，為細胞粘附、細胞遷移提供機械支持，并介導細胞的遷移、定位、極化和信號傳導。目前，包括結(jié)腸、胃、肝臟和胰腺等大多數(shù)類器官的培養(yǎng)都依賴于Matrigel水凝膠基質(zhì)進行。Matrigel固然有多功能性和可負擔性優(yōu)勢，但成份極其復雜，含有包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，和TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子等多種生長因子，蛋白質(zhì)的種數(shù)超過1800種。過于復雜的組份造成制品組成的批次間差異和類器官培養(yǎng)體系不穩(wěn)定，導致培養(yǎng)的類器官存在較大批次間差異，不利于類器官標準化穩(wěn)定生產(chǎn)質(zhì)量^[46-49] 。目前看，類器官培養(yǎng)中的Matrigel過度依賴給類器官生成過程質(zhì)控管理造成的困難還只是一方面。Matrigel的使用還有更關(guān)鍵的問題值得關(guān)注。
       首先，Matrigel不是類器官培養(yǎng)的“萬金油”。Matrigel基質(zhì)的機械性能還不夠理想，如彈性模量(elastic modulus，為衡量材料產(chǎn)生彈性變形難易程度的指標)、孔徑、應力松弛(stress relaxation)和蠕變(creep，是指在力作用下固體材料發(fā)生的緩慢永久性變形現(xiàn)象)，在樣品內(nèi)部存在異質(zhì)性?；|(zhì)內(nèi)部機械支持屬性的不均衡對細胞生長分化的影響，難以與培養(yǎng)體系內(nèi)部化學信號對細胞的影響有效區(qū)分[46]。一方面，由于Matrigel基質(zhì)成份過于繁雜，不適合未分化iPSCs和類器官的維持階段使用，而主要用于各種干細胞分化誘導^[47] 。因源自成熟組織活檢材料衍生的上皮類器官往往保持有源組織的病理生理狀態(tài)特征，而Matrigel基質(zhì)中的組分會對成熟組織來源的上皮類器官擴增和分化產(chǎn)生干擾。另一方面，Matrigel源于腫瘤ECM成分，其所含的層粘連蛋白層粘連蛋白、生長因子等組分，通常都是在腫瘤組織中高度表達的。因而Matrigel與其它正常組織的基質(zhì)體大不相同，往往因缺少形成特定類器官分化所需細胞信號成分，無法為腸道等類型類器官提供組織特異性微環(huán)境 [48]。據(jù)報道，由于層粘連蛋白-511的數(shù)量不足及缺乏間充質(zhì)細胞(mesenchymal cells)等其他細胞，在Matrigel培養(yǎng)的腸道類器官缺乏哺乳動物腸道的一些特征性結(jié)構(gòu) ^[46] 。
        其次，是Matrigel基質(zhì)的臨床使用法規(guī)限制問題。有關(guān)國家臨床治療用生物制品的生物成分標準、腫瘤衍生材料安全性的GMP監(jiān)管標準，要求包括類器官在內(nèi)的生產(chǎn)過程中，必須減少或完全消除血清和動物源性產(chǎn)品的使用。而Matrigel提取至異種動物腫瘤細胞基底膜，具有潛在免疫原性和病原體轉(zhuǎn)移的風險，限制了Matrigel培養(yǎng)的類器官在患者特異性靶向免疫細胞人類臨床植入療法、藥物開發(fā)中的有效應用 ^[47] 。
        Matrigel性能、適用性的局限性，推動類器官的大規(guī)模生產(chǎn)中對化學成分明確、非動物源性(animal origin-free, CD-AOF)培養(yǎng)基和補充劑等ECM基質(zhì)替代品的開發(fā)，以掃除目前異種生物來源培養(yǎng)方法依賴的臨床適用性障礙。
        聚乙二醇、納米纖維素、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物等人工合成或半合成ECM基質(zhì)，其組成成分明確、物理化學特性可控和可重復批次制備。與動物來源的 Matrigel 相比，新型聚合物ECM，可以根據(jù)需要控制各種生物物理特性（合成聚合物的含水量、孔隙率、剛度和剛度）和生物分子的添加，合成更高效，消除了內(nèi)毒素和炎癥蛋白等干擾類器官的生長和可重復性^[49] 。這種合成 ECM 在支持來自多個不同供體以及腸道和子宮內(nèi)膜的人類類器官培養(yǎng)，還可能推廣至其他上皮類器官培養(yǎng)^[50] 。
        在胃腸道組織來源的細胞外基質(zhì)水凝膠（gastrointestinal tissue-derived extracellular matrix hydrogels）中生長的胃或腸道類器官的發(fā)育和功能與 Matrigel 中的類器官相當或通常優(yōu)于Matrigel。此外，通過提供胃腸道組織模擬微環(huán)境實現(xiàn)了類器官的長期傳代培養(yǎng)和移植。當前金標準 Matrigel 的有效替代品，并產(chǎn)生適用于胃腸道疾病建模、藥物開發(fā)和組織再生的類器官^[46] 。
        層粘連蛋白-511(laminin-511)是第一個也是唯一一個對 hESC具有比Matrigel提供的更強粘合性能的替代底物，可在無異種成分培養(yǎng)條件下支持 hESCs 和 hiPSCs 的持續(xù)自我更新。采用聚合物聚異氰肽 (polyisocyanopeptides, PIC)和層粘連蛋白(laminin)復合型水凝膠，在肝類器官培養(yǎng)中，與使用 Matrigel相當?shù)募毎鲋乘芰?，可有效地分化為具有關(guān)鍵肝功能的肝細胞樣表型。這種增殖和分化至少維持14次傳代。展示了PIC在人類肝臟類器官培養(yǎng)方面的巨大應用價值^[47,51] 。
       目前，人工合成ECM水凝膠還需改進以完全重建天然組織的ECM環(huán)境組成并促進類器官發(fā)育和成熟。同時，種類較少，適用范圍較單一，具有多種組織類器官普適性的非動物源ECM基質(zhì)尚未實現(xiàn)大規(guī)模商品化普及。

3.3 最重要的是類器官構(gòu)建技術(shù)標準體系不完善

       作為近10年來生物醫(yī)學和臨床醫(yī)學最熱門的前沿技術(shù)之一，類器官技術(shù)研究應用進展迅猛，人體多個器官均有其類器官的建立及應用的報道。

類器官構(gòu)建操作流程涉及到組織樣本前處理、原代細胞分離培養(yǎng)、干細胞重編程誘導、干細胞的分化培養(yǎng)、3D類器官培養(yǎng)、類器官傳代擴增、低溫貯藏與復蘇等多個環(huán)節(jié)^[52] 。為確保產(chǎn)出的類器官模型的穩(wěn)健性，從原代細胞、誘導多能干細胞和最終生成類器官，過程的關(guān)鍵節(jié)點需進行相應質(zhì)量控制。最終生成的類器官，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能活性檢測到表型表征分析。

       不同組織細胞來源的類器官（如肝臟、腸道、心臟等），培養(yǎng)方法等存在差異。目前，多數(shù)實驗室條件下的類器官的培養(yǎng)主要依賴于主觀經(jīng)驗和手工操作。諸如培養(yǎng)基和組成和更新頻次、傳代培養(yǎng)時機的把握、誘導分化過程中添加生長因子的種類和時機控制等，不同實驗室構(gòu)建的類器官模型間會存在差異。

       類器官雖能保留親本組織的遺傳特征和生物學功能，但長期傳代、冷凍保存和復蘇再培養(yǎng)對不同組織細胞分子特性的影響尚不十分明確。不同組織細胞誘導條件下的多能干細胞及所生成的類器官穩(wěn)健性不一，而對生成類器官所用的多能干細胞傳代代數(shù)目前并無統(tǒng)一標準。

       與相對應的器官擁有類似的空間組織并能夠重現(xiàn)對應器官的部分功能。選擇能準確反映類器官質(zhì)量和功能的指標，以確定類器官在多大程度上還原了體內(nèi)器官真實情況，并據(jù)此作為類器官質(zhì)量評價標準，仍充滿挑戰(zhàn)性。一是因為不同種類的類器官功能不同，表征其結(jié)構(gòu)、功能活性、生物標志物的檢測方法與指標不同。二是不同實驗室硬件資源配置不一，可利用的硬件條件參差不齊，給制定統(tǒng)一的類器官表征標準帶來困難。

四、對類器官技術(shù)研究認識的誤區(qū)

       類器官技術(shù)研究和應用目前正處于技術(shù)爆發(fā)階段的階段。研究成果報道及商業(yè)化應用宣傳信息撲面而來，很容易讓人陷入信息繭房。就我們所掌握的資料看，關(guān)于類器官技術(shù)研究應該避免以下認知誤區(qū)。

       誤區(qū)1：類器官即人體類器官。

       事實上，目前公開實驗報告中，衍生類器官所用初始組織細胞材料或構(gòu)建成類器官，有相當部分項目，特別是與胚胎發(fā)育有關(guān)的應用，都與嚙齒類動物、家畜和靈長類動物等類器官有關(guān)^{[43, 53-55]} 。

       誤區(qū)2：類器官芯片先進論。

       須知，類器官模型芯片化主要目的之一是解決新藥篩選對高通量的需求問題。并非所有組織細胞、類器官模型都已商品化，通過購買即可立即啟動實驗。以再生醫(yī)學應用為目標的類器官研究，就難以通過類器官芯片的技術(shù)路線來實現(xiàn)。相反，目前大量公開報道中，無論是論文數(shù)量和文章質(zhì)量和影響力，居支配地位的并非類器官芯片。

       誤區(qū)3：類器官自動化工作站萬能論。

       類器官自動化工作站是集成了CO2培養(yǎng)環(huán)境控制模塊、自動移液工作站、自動微孔板機械臂和倒置顯微成像系統(tǒng)的一體式自動控制系統(tǒng)，通過個性化編程或基于預置應用協(xié)議，可實現(xiàn)從多能干細胞的誘導分化、培養(yǎng)期間自動移液和培養(yǎng)基更新、維持穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)環(huán)境，到微孔板細胞載體內(nèi)類器官定期成像監(jiān)測與分析全流程的自動實施。核心優(yōu)勢是能執(zhí)行標準化的類器官培養(yǎng)協(xié)議，將實驗人員從繁重操作中解放而可以把主要精力集中在實驗目標與方案優(yōu)化設計上。特別適合藥物研發(fā)場景下測試目標較固定、實驗方案標準化、有通量與效率要求的單線程實驗。
        類器官培養(yǎng)實驗耗時動輒數(shù)周甚至數(shù)月，自動工作站既不能縮短培養(yǎng)時間，也難以滿足多個不同類型類器官共享一套系統(tǒng)同步的培養(yǎng)要求。因此，單一臺套工作站實驗任務預約接待量十分有限。
        而類器官實驗初學者，在類器官實驗流程引進、復制成功并標準化前，依靠工作站提供的極其有限的應用協(xié)議基礎上實現(xiàn)實驗流程編程優(yōu)化絕非易事，寄希望于自動化工作站實現(xiàn)walk-away傻瓜式工作，恐難如愿。

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